多种测序技术在药品检测环境微生物鉴定分析中的应用

多种测序技术在药品检测环境微生物鉴定分析中的应用

陈衡芳

浙江金华康恩贝生物制药有限公司 浙江省金华市 321000

【摘要】目的 围绕药品检测环境微生物，采用多种测序技术对其实施鉴定分析，评定其应用价值。方法 以药品微生物实验室为对象，采集、收集其环境当中的细菌（248株）、霉菌（6株），实施鉴定操作（全自动微生物生化鉴定仪）。依据所得到的生化鉴定结果，基于种属分类学，选择20种具有代表性的细菌（28株）与霉菌（6株），分别用宏基因组测序技术（Hiseq2000与Ion torrent测序平台）、一代测序技术（基于ABI3500测序平台）实施鉴定分析，对菌株鉴定方法所具有的准确性进行相互验证。结果 在28株细菌当中，较之生化鉴定，16SrDNA一代测序鉴定有23株属水平分类一致，10株种水平分类一致。用Hiseq2000对细菌混合实施全基因测序鉴定，较之16SrDNA一代测序，15株种水平一致，2株属水平一致；针对霉菌全基因组测序而言，得到菌信息3株，相比于一代测序结果（霉菌LSU rDNA），3株菌信息缺失。用Ion torrent开展16S rDNA宏基因组测序鉴定，与16S rDNA一代测序结果相比较，有11种对应，且10种属对一代测序当中的28株菌进行了覆盖。结论 针对新一代的宏基因组测序技术及配套的分析方法而言，需持续健全与优化，方能快速、准确的对环境微生物混合菌株实施鉴定，更好的实施建库溯源工作。

【关键词】药品检测环境；测序技术；微生物鉴定

针对微生物污染而言，从基础层面来分析，乃是药品生产及评估产品质量的关键性指标，同时还是对药品安全生产造成影响的常见隐患。现阶段，在生产药品时，环境监控的监测指标多为空气当中的沉降菌、浮游菌计数，缺少对微生物污染实施调查、溯源的方法。伴随分子生物学技术的逐渐成熟，依据DNA序列所存在的差异，可鉴定微生物，此法较之常规的生化鉴定技术，简便且准确。比如LSU rDNA序列（真菌中）、16S rDNA序列（细菌中），由于其存在明显的特异性、保守性，通过对此序列展开测序分析，可实现对微生物的快速分类。但如果围绕微生物污染开展溯源分析时，需要把微生物鉴定至种以下水平，故需选用精确度更高的微生物鉴定技术。所谓基因组重测序，其实际就是对物种（已知基因组序列）开展各个体的基因组测序，且基于此，对个体开展差异性分析，因而能够对微生物（同一种属）开展更深入的分类与溯源分析。本文围绕微生物实验室环境，从中对细菌、霉菌展开采集，且用全自动微生物生化鉴定仪实施鉴定，与各采样时间与来源相结合，依据生化鉴定结果对环境当中具有代表性的细菌、霉菌进行选定，当作样本库，分别用宏基因测序技术、一代测序技术鉴定分析此样本库当中的菌株，就环境微生物鉴定中不同测序技术的可行性，现探讨如下。

1.材料与方法

1.1仪器与菌株

（1）仪器。日本奥林巴斯公司生产的ECLIPSE 50i型数码摄影生物显微镜；法国梅里埃公司生产的全自动微生物生化仪（VITEK 2 Compact型）；法国梅里埃公司生产的全自动革兰氏染色仪；美国ABI公司生产的Verti PCR仪（梯度96孔）；美国ABI公司生产的全自动微生物基因分析鉴定系统（3500 Micro Seq型）；美国Bio-Rad公司生产的电泳仪（Powerpac Basic型）。（2）菌株。在微生物实验室范围内，以其环境当中的设备材料、人员等为对象，用胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板，联合擦拭法、空气沉降法、接触碟法等，采集微生物样本，得到霉菌6株、细菌248株，在实施划线分离、纯化操作后，进行保存。

1.2方法

（1）生化鉴定。围绕细菌（248株），用VITEK 2Compact，依据革兰染色镜检结果，对各种鉴定试剂卡进行选取（如BCL、GN、GP卡等），依据说明书开展生化鉴定。（2）一代测序鉴定。依据生化鉴定结果，与各采样时间与来源相结合，选28株细菌（芽孢杆菌、革兰氏阴性菌等），用全自动微生物基因分析鉴定系统及其相配套的试剂，依据说明书对细菌、霉菌相对应的TSA平板培养物，开展各项操作，如PCR扩增与纯化，DNA抽提等，最后开展毛细管电泳测序（真菌LSU rDNA与细菌16S rDNA）。（3）采用高通量测序平台测定宏基因组测序。把细菌等比例混合，用蛋白酶K-CTAB法对总DNA进行提取。待提取细菌与霉菌总DNA后，用高通量测序平台开展宏基因组建库测序，且分析信息。并用Ion torrent测序平台测序鉴定、分析真菌ITS2、细菌16S rDNA。（4）对PCR反应进行验证试验（Hiseq 2000测序结果）。参照Hiseq 2000宏基因组测序结果，对引物序列进行验证，例如PA:5’-GGCATAGCTCCCAACCAGTAAT-3’等。

2.结果

在28株细菌当中，较之生化鉴定，16SrDNA一代测序鉴定有23株属水平分类一致，10株种水平分类一致。用Hiseq2000对细菌混合（28株）实施全基因测序鉴定，得到菌株信息为78种，较之16SrDNA一代测序，15株种水平一致，2株属水平一致，3株菌信息缺失，61株菌信息多出；针对霉菌全基因组测序而言，得到菌信息3株，相比于一代测序结果（霉菌LSU rDNA），3株菌信息缺失。用Ion torrent开展16S rDNA宏基因组测序鉴定（28株菌混合），得到13种、10属与7科，与16S rDNA一代测序结果相比较，有11种对应，且10种属对一代测序当中的28株菌进行了覆盖；对于霉菌ITS2宏基因组来考量，其测序结果囊括3种、4属，4属对霉菌一代测序结果当中的6株菌进行了覆盖，但在种水平上，仅烟曲霉一致于一代测序结果。

3.讨论

需强调的是，基于细菌分离株而构建的16S rDNA扩增及测序，被当作对细菌实施鉴定、分类等操作的“金标准”，所以，在对细菌的16S rDNA开展一代测序鉴定操作时，选用3500Micro Seq系统，且配合成熟的比对数据库，通常能够比较准确的对至种或者属水平进行鉴定。对于Hiseq 2000全基因组测序来分析，2×100bp为其测序模式，由于存在着较短的测序片段，难以实施序列组装，可能会产生较多的基因片段信息，从而影响到结果的分析。本文围绕HMP、NCBI-Bacteria、NCBI-Fungi等数据库展开比对，完成组装的序列需要对比于已经成熟的数据库。现阶段，缺少健全的全基因组环境微生物菌库，例如HMP数据库多对人类微生物组进行收集，故健全的比对数据库，对于微生物宏基因组测序结果的正确、高效、全面分析，十分关键。当采用Ion torrent平台，围绕真菌ITS2宏基因组、细菌16S rDNA，开展基因组测序鉴定时，此法在属水平上方面的结果，一致于一代测序结果，但在种水平方面，却有着不足的信息量。由于16S rDNA宏基因组测序所选择的是400bp测序模式，无需序列组装，因此，有着更好的结果准确性，但也因有着较短的分析序列，仅能对16S rDNA当中的若干高变区进行检测，因此，通常仅可能对至属实施鉴定。从本文结果发现，生化鉴定比较复杂，并且对一些菌株进行鉴定时，仅能至属，而对于16S rDNA一代测序来讲，通常能够鉴定至种，有诸多优点，如准确、高效等。对于新一代宏基因组测序而言，能够围绕混合样本，以此鉴定分析，具有快速、更好通量等优点，但受限于数据库、分析方法，导致结果不准确。本文新一代测序技术，在鉴定混合微生物菌株方面，并不完善，仅能对至属进行鉴定。所以，新一代测序技术及分析方法需持续优化，这样才能更加快速、准确的对混合菌株实施鉴定，且为建库溯源工作开展提供辅助。

参考文献：

[1]张斌，王晓闻.基于高通量测序技术鉴定酸浆水中的微生物[J].中国调味品，2020，45（4）：77-80.

[2]郑凯文，黄晓园，陈渡波，等.基于多重PCR和第二代高通量测序技术快速检测下呼吸道感染病原微生物方法的建立和应用[J].国际检验医学杂志，2020，41（17）：2066-2070.

[3]曹美英.药品微生物检测实验室质量控制措施分析[J].化工管理，2018（36）：115-116.