高效液相色谱-质谱联用法测定化妆品中16α-羟基泼尼松龙的不确定度评定

高效液相色谱-质谱联用法测定化妆品中16α-羟基泼尼松龙的不确定度评定

杜俊威   ,林蔚文  ,黄润  ,罗伟  ,范梅娟

东莞市食品药品检验所  广东  东莞  523000

摘要  本文通过分层建立高效液相色谱-质谱联用法测定化妆品中16α-羟基泼尼松龙的数学模型，对测量过程中不确定度的来源和影响因素进行逐一分析和合成，运用最小二乘法对外标曲线拟合的不确定度进行了评定，最终量化各不确定度分量，提供了该方法的合成不确定度的评估结果，使该方法在仪器环境不变时测量的结果受控。

关键词：高效液相色谱-质谱联用法；16α-羟基泼尼松龙；不确定度

Determination of 16 in cosmetics by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry α- Evaluation of uncertainty of hydroxy prednisolone

Du Junwei

(Dongguan Food and Drug Inspection Institute, Dongguan 523000, Guangdong)

Abstract: This article establishes a high-performance liquid chromatography-mass spectrometry method for the determination of 16 in cosmetics by layering α- The mathematical model of hydroxy prednisolone is used to analyze and synthesize the sources and influencing factors of uncertainty in the measurement process one by one. The least square method is used to evaluate the uncertainty of external standard curve fitting. Finally, the uncertainty components are quantified, and the evaluation results of the combined uncertainty of this method are provided, so that the measurement results of this method can be controlled when the instrument environment is unchanged.

Keywords: High performance liquid chromatography mass spectrometry; sixteen α- Hydroxyprednisolone; Uncertainty

    16α-羟基泼尼松龙属于糖皮质激素的一种，为了完善祛痘类化妆品中糖皮质激素测定的覆盖面，国家药监局新发布《化妆品中16α-羟基泼尼松龙的测定》化妆品补充检验方法（BJH 202203）。为了检测数据的处理、检测结果的表达以及结果的质量评定等方面与国际接轨，比符合中国实验室国家认可委员会（CNAL）对认可实验室在测量不确定度的要求，根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度的评定与表达》，并参考《CNAS-GL006-2019 化学分析中不确定度的评估指南》，结果检验方法与数学模型，对高效液相色谱-质谱联用法测定16α-羟基泼尼松龙的结果进行不确定度评定和分析。

1、概述

1.1环境条件：温度20℃，相对湿度50%。

1.2仪器设备

(1)电子分析天平，精度0.01mg至0.1mg，经鉴定最大允许误差±0.05mg。

(2)高效液相色谱-质谱联用仪 AB5500+ QTrap,定量重复性4.5%。

(3)eppendorf可调移液器,10-100μL、20-200μL、100-1000μL

1.3试剂于试药:16α-羟基泼尼松龙对照品（来源：Bepure,使用前不需干燥处理，批号：F0061055，含量：98.7%)

1.4检验依据《化妆品中16α-羟基泼尼松龙的测定》化妆品补充检验方法（BJH 202203）

2、检测步骤

2.1标准储备溶液：精密称取16α-羟基泼尼松龙标准品10mg（精确到0.00001g），置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀。该标准储备溶液的质量浓度为1000mg/L。置于-18℃冰箱中保存。

2.2标准中间溶液制备：精密移取16α-羟基泼尼松龙标准储备溶液（1000mg/L）1.0mL，置于100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀。该标准溶液的质量浓度为10mg/L。

2.3空白基质提取液制备：称取空白试样0.2g（精确到0.0001g），置于10mL具塞比色管中，自“加入50%乙腈约9mL”起与样品同法处理，作为空白基质提取液。

2.4基质标准中间溶液制备：精密量取16α-羟基泼尼松龙标准中间溶液（10mg/L）0.1mL，置于10mL容量瓶中，用空白基质提取液稀释至刻度，摇匀，制成16α-羟基泼尼松龙浓度为100μg/L的基质标准中间液。基质标准中间液现用现配。

2.5基质标准系列溶液制备：准确量取基质标准中间溶液（100μg/L）0.02mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2mL、0.5 mL，分别置于10 mL、10 mL、10 mL、10 mL、10 mL棕色容量瓶中，用空白基质提取液稀释至刻度，配制成浓度为0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L的基质标准系列溶液，应现用现配。

2.6样品处理：称取样品0.2g（精确到0.0001g），置于10mL具塞比色管中，加入50%乙腈约9mL，涡旋振荡，使试样与提取溶剂充分混匀。超声提取10min，静置至室温，用50%乙腈定容至刻度，摇匀，以10000r/min转速离心10min，取上清液经0.22μm有机滤膜过滤，滤液作为供试品溶液备用。

2.7仪器条件：色谱柱：C18 (2.1 mm×100 mm，2.7µm)，流速：0.3mL/min，柱温：30℃，进样量：5μL，流动相A：水，流动相B：乙腈。

质谱条件：监测模式为负离子反应监测模式（MRM），电喷雾电压（IS）:4500V，气帘气（CUR）:35mL/min，雾化器（GS1）:45 mL/min，辅助气压力（GS2）: 45mL/min，离子源温度（TEM）:500℃，监测离子对及相关参数见下表。

*为推荐的定量离子。

2.8定量测定：取标准系列溶液依次测定，以待测组分的系列浓度为横坐标，待测组分的峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，其线性相关系数应大于0.99。取供试品溶液测定，将对应的定量离子对色谱峰面积代入标准曲线。按公式计算待测组分的含量。

3、数学模型

试样中16α-羟基泼尼松龙的计算公式如下：

…………………………………………………(1)

ρ=(R-a)/b……………………………………………………（2）

式中：

ω—样品中比16α-羟基泼尼松龙的质量分数，mg/kg；

ρ—供试品溶液中16α-羟基泼尼松龙的质量浓度，μg/L；

V—样品定容体积，mL；

m—样品取样量，g；

D—稀释倍数（如未稀释则为1）。

R—样品中16α-羟基泼尼松龙的峰面积。

a，b—标准曲线的截距、斜率。

4、不确定度的来源及分析

4.1不确定度的来来源：根据计算公式，分析测定的每一步骤的主要影响因素，在每一个主要影响因素以外，考虑增加有贡献的影响因素，直至影响因素变得足够小，对结果的影响可忽略。见以下因果图。

对照品来源   对照品称样量   对照品定容与稀释

温度效应与体积效应

标曲

仪器响应

X

天平误差                         温度效应与体积效应

样品称样量                   样品定容体积                                        仪器RSD

4.2不确定度的量化分析

4.2.1 A类不确定度分析：样品一式10份，测定结果分别为：0.0372、0.0370、0.0367、0.0365、0.0369、0.0373、0.0361、0.0364、0.0367、0.0368mg/kg，平均值为0.0368mg/kg，标准偏差为0.00036，多次重复测量的A类相对不确定度：urel.C(A)==0.0031

4.2.2 B类不确定度分析

4.2.2.1对照品来源：16α-羟基泼尼松龙对照品含量为98.7%，由北京振翔生物科技有限公司提供，批号为F0061055，对照品证书上提供扩展不确定度为±2.0%，包含因子K=2,即对照品含量的标准不确定度：u (A)=0.01。 相对不确定度为标准不确定度除以称样量（以10.17mg计算）为: urel(A)=0.000983。

4.2.2.2对照品称样量：所用仪器为CPA225D电子天平，精度0.01mg。经鉴定天平的最大允许误差±0.05mg，按照均匀分布 =0.0289。由于减量法称重计算2次，对照品称重引入的标准不确定度：=0.0410。相对不确定度为标准不确定度除以称样量（以10.17mg计算）为              urel(B)=0.0040。

4.2.2.3配制标准储备液（1000mg/L）：定容到10mL量瓶中，该10mL量瓶检定为A级，最大容量误差为±0.02mL，按照均匀分布，不确定度为 =0.0115，考虑温度效应：实验室温度为（20±2）℃，乙腈的体积膨胀系数为1.37×10-3 ml/℃，按照均匀分布评定，不确定度为

=0.0158，两项合并， =0.0195，相对不确定度为：urel(C)=0.00195。

4.2.2.4配制标准溶液（10mg/L）:吸取标准储备液（1000mg/L）1000μL，使用的100～1000μL移液器经鉴定，移取1000μL时误差为8.76μL，按照均匀分布，不确定度为=5.058，考虑温度效应：实验室温度为（20±2）℃，乙腈的体积膨胀系数为1.37×10-3 ml/℃，按照均匀分布评定，不确定度为 =1.582，两项合并， =5.300，相对不确定度为：urel(D)= =0.00530。

5结论

    分析评估不确定度时，尽量注意产生不确定度的所有来源，因为合成不确定度的数值几乎完全取决于各不确定度的分量，由上述分析可看出，本方法测量结果的不确定度主要来自对照品于供试品的称量、稀释、定容、系列标准曲线的拟合，以及仪器的重复测定。因此，在测定样品时，必须严格控制实验条件，并规范操作。

参考文献

[1]国家质量监督检验检疫总局，JJF1059.1-2012，测量不确定度评定与表示.北京：中国质检出版社，2013:4-13.

[2]罗刚.不确定度A类评定及不确定度B类评定的探讨.计量与测试技术，2007,34（12）：42-43

[3]中国合格评定国家认可委员会，化学分析中不确定度的评估指南.CNAS-GL06，2019:26～29

[4]化 妆 品 补 充 检 验 方 法 BJH 202203 化妆品中 16α-羟基泼尼松龙的测定