海南地区居民中黎族与汉族地区慢性牙周炎患者牙周致病菌差异的初步研究

海南地区居民中黎族与汉族地区慢性牙周炎患者牙周致病菌差异的初步研究

符静 ,关薇薇 ,陈绍山 ,张文柏 ,陈菲 ,陈积磊

中南大学湘雅医学院附属海口医院·海南省口腔医学中心牙周病科 海南海口 570208

[摘要]目的：分析黎族地区与汉族地区慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙周致病菌的差异。方法：应用以16SrRNA为基础的聚合酶链反应（PCR）技术，检测黎族、汉族地区的慢性牙周炎（CP）患者和牙周健康（PH）者龈下菌斑中6种牙周可疑致病菌，包括牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）、福赛坦氏菌（T.forsythia）、齿垢密螺旋体（T.denticola）、伴放线放线杆菌（A.actinomycetemcomitans）、中间普氏菌（P.intermedia）和具核梭杆菌（F.nucleatum）。结果：黎族CP组P.gingivalis、T.forsythia、T.denticola、A.actinomycetemcomitans、P.intermedia、F.nucleatum检出率分别为：90%、100%、80%、60%、85%、85%，明显高于PH组（P<0.05）；汉族CP组P.gingivalis、T.forsythia、T.denticola、A.actinomycetemcomitans、P.intermedia、F.nucleatum检出率分别为60%、85%、50%、55%、75%、75%，明显高于PH组（P<0.05）；P.gingivalis、T.denticola在黎族CP组的检出率高于汉族CP组（P<0.05）。结论：6种细菌在黎族CP患者龈下菌斑中均有较高检出率；黎族地区与汉族地区CP患者龈下菌斑中P.gingivalis、T.denticola检出率有明显差异。

[关键词]黎族；汉族；牙周炎；龈下菌斑；牙周致病菌

慢性牙周炎是由牙菌斑微生物群中的致病菌持续破坏牙齿支持组织引发的感染性疾病，占牙周炎患者的95%，多发于成年人，也偶可发生于青少年和儿童，是牙齿丧失的主要原因[1]。目前，国内针对慢性牙周炎致病菌的研究主要集中在汉族人群，对黎族人群的牙周致病菌尚未见有专项、系统的研究。2015年全省人口中黎族人口约149万人，占人口总数的16.4%，因此，开展此项研究具有十分重要的临床指导意义[2]。本课题通过分组对患有慢性牙周炎的黎族人群和汉族人群进行对比研究，采用龈沟试子收集受检者龈沟液样本，分析其与临床牙周指数的相关性，使用以16SrRNA为基础的PCR技术，检测受检者龈下菌斑中的Td、Fn、Pg、Pi、Aa和Tf等6种可疑牙周致病菌的阳性检出率，对比黎族患者与汉族患者在慢性牙周炎牙周致病菌上存在的差异，寻找导致黎族居民慢性牙周炎的可疑致病菌，为海南地区黎族慢性牙周炎患者的针对性治疗提供理论基础。

1材料和方法

1.1研究对象

收集申请单位就诊的海南地区黎族人患CP的患者的完整病例资料。采用国际牙周病分类标准，(所有第三磨牙不纳入)，应用常规牙周专科病历对临床各项指标进行统计；排除不良修复体，食物嵌塞、邻面龋、牙髓及根尖周病等局部促进因素及接受过正畸治疗等的患者后纳入：CP组：全口至少有30%探诊位点存在牙槽骨破坏和附着丧失，牙周袋≥3mm,临床附着丧失≥1mm；每例患者均拍摄X线片，证实有邻面牙槽骨吸收。健康对照组：全口牙周检查探诊深度≤3mm，无临床附着丧失，出血指数≥2的位点不超过25％，无出血指数≥4的位点。两组均都无糖尿病、心血管疾病和血液病等系统性疾病；女性患者未妊娠。三个月内未服用过抗生素及进行牙周治疗及相关治疗。

1.2主要实验材料与仪器

标准菌株（口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学），细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），引物（上海捷瑞生物工程有限公司），KPWHO牙周袋刻度探针（上海康桥齿科医械厂），PTC-100型聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增仪（BIORAD公司，美国），自动凝胶成像分析仪（安莱公司，美国）。

1.3方法

1.3.1检查方法

自然光线下，用平面口镜、牙周袋刻度探针和普通探针，以视诊结合探诊的方式对受检者进行牙周检查。取全口4个象限的第一、二磨牙和右侧上颌中切牙、左侧下颌中切牙为指数牙，记录其菌斑指数、牙龈出血指数、探诊深度等牙周临床检查指标。所有CP患者均拍摄全口根尖片，证实其存在邻面牙槽骨的吸收。牙周袋深度、附着丧失诊断标准均参照第三次全国口腔健康流行病学调查标准。

1.3.2样本采集和处理

采集每位受检者龈沟液标本：采用吸取法收集lml龈沟液置于无菌微量离心(EP)管，龈沟拭子密闭于无菌试管中，4℃备用或-20℃保存。

1.3.3引物合成与PCR检测

6种细菌的引物来自编码16SrRNA的基因（具体引物序列及扩增片段见表1），用PCR扩增仪对龈下菌斑细菌基因组DNA进行PCR扩增，取扩增产物，以6种国际参考标准菌株即P.gingivalis（ATCC33277）、A.actinomycetemcomitans（ATCC29523）、T.denticola（ATCC43037）、F.nucleatum（ATCC25586）、P.intermedia（ATCC25611）、T.forsythia（ATCC43037）为阳性对照，变异链球菌（ATCC27607）为阴性对照，100V电压下2％琼脂糖凝胶电泳50min后，以DNAMarkerDL1000为DNA相对分子质量标准，紫外线检测仪下观察扩增带。

1.4统计学分析

使用SPSS20.0统计软件，计量资料采用独立样本t检验，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1PCR产物电泳结果

以DNAMarkerDL1000为DNA相对分子质量标准，6种国际参考标准菌株为阳性对照，变异链球菌为阴性对照，将各组龈下菌斑致病菌PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在412bp处可检测到P.gingivalis目的片段，在557bp处可检测到A.actinomycetemcomitans目的片段，在316bp处可检测到T.denticola目的片段，在161bp处可检测到F.nucleatum目的片段，在267bp处可检测到P.intermedia目的片段，在641bp处可检测到T.forsythia目的片段。

表16种细菌的特异性引物序列

2.26种微生物在黎族CP组、PH组和汉族CP组、PH组的检出率比较

6种微生物在各组的检出率见表2。P.gingivalis、T.forsythia、T.denticola、A.actinomycetemcomitans、P.intermedia、F.nucleatum在黎族CP组的检出率分别为：90%、100%、80%、60%、85%、85%，明显高于PH组（P<0.05）；P.gingivalis、T.forsythia、T.denticola、A.actinomycetemcomitans、P.intermedia、F.nucleatum在汉族CP组的检出率分别为60%、85%、50%、55%、75%、75%，明显高于PH组（P<0.05）；P.gingivalis、T.denticola在黎族CP组的检出率分别为90%、80%，明显高于汉族CP组（P<0.05）。

表26种微生物在各组的检出情况

3讨论

口腔做为微生物生存的最佳场所，存在着数百种微生物，与宿主之间相互依存共同构成口腔生态系，并维持口腔生态系的动态平衡。这种平衡对于维持牙齿支持组织的健康非常重要，但由于微生物菌丛的多样性、多变性、口腔卫生习惯生活饮食习惯等因素影响，导致口腔生态环境群落失调，进而导致一种或几种具有显著毒力或致病性的致病菌成为优势菌[3]。此类致病菌能够通过干扰多种机制干扰宿主防御能力，引发牙周破坏的潜能，导致慢性牙周炎(chronicperiodontitis,CP)的发生。本课题研究的CP就是由牙菌斑微生物群中的致病菌持续性、进行性破坏牙齿支持组织导致的感染性疾病，临床表现为牙龈炎症、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙齿松动等，是牙齿丧失的主要原因[4]。牙周致病菌毒性因子及其毒性产物直接破坏牙周组织，并激活宿主免疫应答，造成牙周的软、硬支持组织免疫损伤，从而导致CP的发生发展。海南为多民族聚居地，据2015年国家统计局公布数据，全省人口总数约911万，其中，黎族人口约149万，占人口总数的16.4%。省内不同地域的独特地理环境和黎族独具特色的饮食内容以及烤、煮、腌、熏等饮食方式，对某些牙周可疑致病菌的定植、生长具有一定影响。目前，国内针对CP致病菌的研究主要集中在汉族人群，尚未细分到某个少数民族，对占海南人口近五分之一的黎族人群进行专项、系统的研究尚未有见到报道，也未见到对黎族患者CP致病菌研究的报道

[5]。本课题拟通过分组，对患有CP的黎族人群和汉族人群进行对比研究，收集受检者龈沟液样本，分析其与临床牙周指数的相关性，采用以16SrRNA为基础的PCR技术，检测受检者龈下菌斑中的可疑牙周致病菌包括：齿垢密螺旋体(Treponemadenticola,Td)具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)、中间普氏菌(Prevotellaintermedia,Pi)、伴放线聚集杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans,Aa)和福赛斯坦纳菌(Tannerellaforsythensis,Tf)等6种可疑牙周致病菌的阳性检出率，对比黎族患者与汉族患者在CP牙周致病菌上存在的差异，寻找导致黎族居民慢性牙周炎的可疑致病菌，为海南地区黎族慢性牙周炎患者的针对性治疗提供理论基础[6]。本研究结果显示，黎族及汉族CP组A.actinomycetemcomitans的阳性检出率明显低于同组其他5种牙周致病菌，其原因可能与研究对象多为非局限性侵袭性牙周炎患者有关，但黎族CP组P.gingivalis、T.denticola的阳性检出率明显高于其他3组，其具体机制仍需进一步研究。以上研究结果提示，黎族特殊环境可能导致CP患者牙周致病菌优势菌群发生改变。

参考文献

[1]吴丽芳.2型糖尿病伴慢性牙周炎患者牙周可疑致病菌的定植研究[J].中国保健营养,2021,31(15):13-14.

[2]徐娟,陈晓涛,于淑琪,等.新疆霍城地区慢性牙周炎两种致病菌的分布研究[J].临床口腔医学杂志,2021,37(7):419-422.

[3]毛甜甜,黄丽,彭若冰,等.盐酸米诺环素软膏辅助龈下刮治术及根面平整术对慢性牙周炎患者龈下牙周致病菌和龈沟液炎性因子的影响[J].现代生物医学进展,2021,21(4):650-653,672.

[4]高碧云,马化兵.Epstein-Barr病毒感染与慢性牙周炎关系的研究进展[J].广西医科大学学报,2021,38(3):623-626.

[5]徐娟,陈晓涛.慢性牙周炎优势致病菌相关毒力因子研究进展[J].家庭医药,2020(1):391.

[6]王倩倩.慢性牙周炎外周血白细胞介素6和白细胞介素8水平及其与疾病严重程度的关系[J].山西医药杂志,2020,49(1):47-49.

【课题基金】海南省卫生健康行业科研项目（20A200134）