细胞治疗产品无菌药典法与替代快速检测方法对比

细胞治疗产品无菌药典法与替代快速检测方法对比

段立平1 ,信淑珍2

中源协和细胞基因工程股份有限公司，邮编：300380

摘要：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。[1]

各国法规药典中对无菌检查的传统的培养法和薄膜过滤法进行了详细的介绍。随着新型生物制品的涌出，细胞制品的普及，对无菌检查提出了新要求。传统培养方法主要表现为在时效性上无法满足这些生物制品的放行检需求，也包括原物料的质检需求，传统的无菌检测方法耗时较长 (需培养 14 d)，需要专业的无菌操作和各种培养设备，费时费力，而且药品中存在的细菌可能处于活的非可培养状态，难以检出，更由于培养基本身限制，只能检出在该培养条件下的可培养菌[2][4] ，因此，各国陆续建议研发和推广采用经过验证的快检方法--快速微生物检测（RMM，Rapid Microbiological Methods）替代传统无菌培养法检查 [6] 。基于生物技术的发展，各国药典及法规均鼓励使用基于新技术的经过全面验证的替代方法[8] 。

关键词：无菌；无菌检查法；快速微生物检测

1. 无菌快检法的方法分类：

由于细胞治疗产品种类多、差异大、性质复杂多变、研究进展快、技术更新迅速、风险程度不同，因此，对于不同类型产品，可基于风险特征和专项控制措施，采用适合其产品的特有技术[7] 。
依据中国药典2020年版9201药品微生物检验替代方法验证指导原则，新的微生物检验技术大体可分为三类：
1.1基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；
1.2直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞计数法、流式细胞计数法等；
1.3基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。

2.适用的被测产品类别：

《细胞类制品微生物检查法通则草案的公示》[3]中指出，快速微生物检查法，主要适用于效期短、批量小、采用现行无菌检查法（通则1101）无法保证在产品使用前完成放行检查的细胞类制品[6] 。
 

3.商品化全自动微生物培养系统的技术：

3.1主要商品化全自动微生物培养系统，通过仪器实时监测微生物生长代谢产生的二氧化碳引起的培养瓶内反应底物的显色或荧光变化信号，或培养瓶顶空压力变化信号，结合目视观察，判定供试品中有无微生物生长。

3.2《细胞和基因治疗产品快速无菌检查法的验证技术要求》中指出，目前细胞和基因治疗产品主要应用的快速无菌检查法主要采用基于微生物生长的原理，其中采用自动化的仪器实时监控微生物呼吸信号的方法为目前最常见的类型，原为临床检测开发，主要用于对血液等体液样本的快速微生物检测，也应用于临床干细胞库检测，该类技术也为欧美药典所推荐。

3.3呼吸信号检测技术包括但不限于以下几种：
基于二氧化碳底物显色的检测技术；
基于荧光增强显示的检测技术；
基于气压感应的检测技术。
 

4. 总结：

4.1针对细胞治疗产品这种效期较短、附加值高又不易过滤的样品，想要提高检出率，CO2比色技术因其干扰少、灵敏度较高等优点在生物药行业目前应用范围最为广泛，可谓是无菌检测替代方法中的首选。
4.2BacT/ALERT®3D 检测原理即为先进的比色技术。瓶底CO2感应器含有溶解染料的硅胶，用于检测微生物生长中产生CO2，产生不可逆颜色变化。而对于没有相应设备的厂家来说，也可以送到第三方实验室进行检测。

4.3相比传统无菌检查需要14天出结果，无菌快检可5-7天出结果，极大的缩短检测、放行时间。在适用范围、专属性、灵敏度污染风险等方面也能符合药典法规要求，是不错的无菌检测替代方法。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2020年版.四部.2020：156-160.

[2] DING L X, SU X M, AKIRA Y. Research progress of VBNC bacteria-A review [J]. Acta Microbio Sin(微生物学报), 2011, 51(7): 858-862.

[3]GB/T 40365-2021细胞无菌检测通则[S].

[4]  实时荧光定量PCR方法应用于药品无菌快速检测的研究[J] 王晓冲,周继昌,李军,王晓炜,应国红.中国现代应用药学 . 2013 (12).

[5] 《美国药典》（42/NF37）＜1071＞无菌短货架期产品放行的快速微生物检查法:依据风险评估的方法[J]. 刘洪祥,李娅男,白海娇,曹晓云.  中国药品标准. 2020(03)

[6] 王诗琳， 于玲莉， 成殷. 快速无菌检查方法在细胞和基因治疗产品中的应用及监管概述[J]. 上海医药， 2022， 43（11）：

14-16； 35.

[7] 国家食品药品监督管理总局. 细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）[EB/OL]. （2017-12-22） [2022-04-02]. https//www.nmpa.gov.cn/directory/web/

nmpa/images/MjAx N8TqtdoyMTa6xc2ouOa4vbz+LmRvY3g=.docx.

[8] 中国食品药品检定研究院. CAR-T细胞质量控制检测研究及非临床研究考虑要点[EB/OL]. （2018-06-05） [2022-04-02].https//news-files.yaozh.com/systemFile_

25/96f5efeb3b1 9339d8b7467bc8e597748.pdf.