基于PI3K/AKT通路探讨芪灵扶正清解颗粒对肝癌细胞凋亡的影响

摘要：目的：基于PI3K/AKT通路探讨芪灵扶正清解颗粒对肝癌细胞凋亡的影响。方法：HepG2细胞培养条件见参考文献^[2]。种板24h后，分为2组，其中空白组更换新鲜培养液培养；给药组以5mg/mL的含芪灵培养液处理，干预48h后继续后续实验。按照传统方法提取蛋白样本。结果：透射电镜结果显示与空白组相比，芪灵组细胞具备明显的早期凋亡特征，证实芪灵扶正清解颗粒能够诱导HepG2细胞凋亡。此外，本研究中芪灵组磷酸化的PI3K、AKT蛋白表达量较空白组显著下降，说明芪灵能够抑制肝癌细胞HepG2中PI3K/AKT通路的活性。结论：芪灵扶正清解颗粒促进肝癌细胞凋亡并抑制其增殖能力收可能与PI3K/AKT信号通路有关。

关键词：肝癌细胞凋亡；芪灵；PI3K/AKT信号通路

肝癌是我国常见的恶性肿瘤，在恶性肿瘤发生率中占第6位，是癌症死亡的第4大原因，严重危害人类健康。祖国医学将肝癌归于“积聚”“癥瘕”等范畴，主要病机为脏腑气血亏虚，邪毒瘀结^[1]。临床观察发现芪灵扶正清解颗粒（以下简称“芪灵”，成分：黄芪、灵芝、山药、夏枯草、白花蛇舌草、女贞子），能够改善晚期肝癌患者放化疗毒副作用，延长生存期。前期研究发现芪灵有促肝癌细胞凋亡的作用，本文通过PI3K/AKT信号通路探索芪灵抗肝癌的作用，以期为肝癌的临床治疗提供理论依据。

1资料与方法

1.1细胞株

HepG2细胞株培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中。

1.2药物与试剂

芪灵购自福建省第三人民医院中药房。PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、鼠抗购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 HepG2细胞培养、处理

HepG2细胞培养条件见参考文献^[2]。种板24h后，分为2组，其中空白组更换新鲜培养液培养；给药组以5mg/mL的含芪灵培养液处理，干预48h后继续后续实验。

1.4透射电镜观察

将HepG2细胞用终浓度为5mg/mL的芪灵扶正清解颗粒处理48 h。收集固定、脱水后，将细胞包埋、切片，用饱和醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。最后用透射电镜观察并拍照。

1.5 Western blotting技术检测PI3K、AKT蛋白表达情况

按照“1.3”项方法分组及处理后收集细胞。按照传统方法提取蛋白样本。随后电泳，封闭结束，以β-Actin（稀释比例1∶1000）作为内参，加入分别加入PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT，稀释比例均为1∶1200。用化学发光成像成像系统显影，用Image J灰度值分析软件分析。

2结果与结论

2.1透射电镜显示细胞凋亡情况

透射电镜结果显示正常组HepG2细胞呈现恶性肿瘤细胞特征，细胞核增大，核膜完整；与正常组相比芪灵组呈现细胞凋亡早期特点，核形不规整，核内异染色质增多，浓缩成团块状，分布在核膜内侧，见图1。

正常组（3000倍标尺=5um）芪灵组（3000倍标尺=5um）

注：箭头所示为异染色质。

图1细胞透射电镜凋亡情况

2.2 PI3K、AKT蛋白表达情况

与空白组相比，芪灵组HepG2细胞中AKT、p-AKT、p-PI3K蛋白的表达量降低（P<0.05），PI3K蛋白表达增加（P<0.05），结果见图5。

图2 PI3K、AKT蛋白表达情况

3讨论

课题组前期研究发现芪灵扶正清解颗粒能够延缓肝癌细胞HepG2增殖，诱导其凋亡^[3]，但具体作用机制尚不明确。本研究中透射电镜结果显示与空白组相比，芪灵组细胞具备明显的早期凋亡特征，证实芪灵扶正清解颗粒能够诱导HepG2细胞凋亡。此外，本研究中芪灵组磷酸化的PI3K、AKT蛋白表达量较空白组显著下降，说明芪灵能够抑制肝癌细胞HepG2中PI3K/AKT通路的活性。

PI3K/AKT通路在人类肿瘤的恶性转化及其随后的生长、增殖和转移中起重要作用。PI3K有三类异构体，是脂质激酶家族中的一员，其中Ⅰ型异构体在肿瘤中起到重要作用。Akt是PI3K下游的一种丝氨酸苏氨酸激酶。经典的PI3K/Akt激活模式中，激活的磷酸化Akt使包括叉头转录因子O亚家族(FOXO)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOＲ)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)等在内的多个下游底物磷酸化，调节细胞生长、增殖和血管新生等各种关键细胞活动^[4]。临床前研究表明，PI3K/AKT通路在肝癌中经常被激活，因此被当做肝癌治疗干预的潜在通路。本研究显示芪灵扶正清解颗粒处理具备凋亡特征，且能够降低肝癌细胞中磷酸化PI3K、AKT蛋白表达。结合前期研究，芪灵扶正清解颗粒可能通过抑制PI3K/AKT信号通路，促进肝癌细胞凋亡。

综上，芪灵扶正清解颗粒促进肝癌细胞凋亡并抑制其增殖能力可能与PI3K/AKT信号通路有关。但本实验并未涉及芪灵扶正清解方发挥作用的具体有效成分和其在PI3K/AKT信号通路中发生调节作用的具体过程，有待后期实验进一步深入研究。

参考文献

[1]诸佳瑜,陈闯,欧杰,等.中医辩证治疗原发性肝癌的研究进展

[J].当代医药论丛,2017,15(10):32-34.

[2]刘云鹤,蔡金保,王红丽.党参多糖抑制PI3K/AKT通路对人肝癌HepG2细胞生长和运动能力的影响[J].中国免疫学杂志,2020,36(09):1108-1113.

[3]章尤权,王清泰,魏建威,等.芪灵扶正清解颗粒对人HepG2肝癌细胞ras基因蛋白表达的影响[J].福建中医药,2014,45(06):54-56+59.

[4]Garcia-Lezana T,Lopez-Canovas JL,Villanueva A.Signaling pathways inhepatocellular carcinoma.Adv Cancer Res.2021;149:63-101.