银杏果实多糖的提取工艺

银杏果实多糖的提取工艺

陈文武

徐州生物工程职业技术学院

摘  要：银杏果含有多种微量元素和营养物质，既可药用，又可食用，可以有效疏通血管，促进体内代谢，美容养颜。国内外研究人员大部分都在对银杏果的其他成分进行研究，银杏果实多糖的报道相对来说较少。本论文以银杏果实为原料，借用蒽酮硫酸比色法进行银杏果实多糖含量测定，来确定热水浸提法是否能够更好的提取银杏果多糖。对具体研究的结果进行了简单的论述：通过采取实验法，即单因素法，从中得出水浴温度和料液比以及浸取时间的最佳提取量范围，经过调整单因素，控制其他变量，最终得出结论。

关键词：银杏果实；提取多糖；蒽酮硫酸比色法；正交试验

1  引言

银杏果的价值一直被人们所重视，这也将银杏果的有效成分慢慢地被大家看见，而银杏果实中的多糖，也被研究员们发现，银杏果中的多糖为酸性多糖，并不是“白果有毒”的凶手，它没有细胞毒性，也具有植物多糖的免疫调节、抗氧化、抑菌等药理活性。水提法是传统提取植物多糖的首选方法，但是该方法的提取率较低，为了克服这个缺点，逐渐也产生了酶解提法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、超临界萃取法等新型提取技术。本课题以银杏果为原材料，借助蒽酮硫酸比色法进行多糖含量测定，经过单因素试验、正交试验，目的是为了确定热水浸提法提取白果多糖的最佳工艺。

2  相关概述

2.1  银杏果简介

银杏(Ginkgo biloba)属银杏科银杏属裸子植物。自古，就被视为珍贵树种，并在我国大范围推广种植,其产量占全世界的70%。之所以称其为珍贵树种，是因为它用途广泛，不仅可以作为食品、药材、木材、化妆品等原料，发挥其经济功能，而且可以美化环境，发挥其生态功能，同时也具有极高的观赏价值。现代银杏树的分布主要靠人工栽培、人工移植，我国是最大的栽植培育基地。其他国家归根究底都是从中国移植得银杏树种。目前已知有银杏树分布的国家有日本，加拿大，俄罗斯，朝鲜，美国等。因为银杏树生长本需要土壤等其他外界环境因素，所以在我国种植银杏树的地方都集中在广西柳州，安徽砀山、山东临沂，江苏邳州以及浙江等地。

银杏果在民间有很多别称，最熟知的是白果,也有一些地区称其为鸭脚子、灵眼、佛指柑，其核仁为可食用部分。2020版药典对银杏果的形状，颜色、味道等内容进行了记载。经常食用银杏果，能够延缓细胞衰老，保持肌肤红润，提高机体新陈代谢，使人延年益寿。

我国关于白果的药用价值最早可以追溯到元代吴瑞著撰写的《日用本草》。从元代以后，后人在《日用本草》的基础上，继续研究，并将研究成果撰写进相关书籍。除了《本草纲目》外，人们熟知的还有《三元延寿书》《滇南本草》《本草再新》等著作。

白果的药理生理活性也被人们所注意到。经过国内外学者研究发现，结核杆菌的生长在白果存在的环境中受到了极大的抑制，而羟基酚类作为白果中的重要结构也在抗癌、抗菌方面发挥着不可忽略的效果。除此之外，白果也能够有效缓解细胞衰老、身体疲劳、体内缺氧等问题，可以预防皮肤病的发生，促进人体表皮细胞生长,延长表皮细胞寿命。但是民间流传着“白果有毒”，对白果的加工利用产生了一些阻力，因此大家可以针对此问题，开创一些新型的白果加工产品。

2.2  银杏果成分

2.2.1  银杏果淀粉

王梅桂的研究内容为银杏淀粉粉丝的制备及其特性研究，利用酸水解法对银杏果中淀粉含量进行测定，测定结果显示银杏果实中淀粉含量约为65%；借助X-衍射仪测定淀粉晶体结构，最终得出:淀粉晶体结构属于CA型;结合仪器对淀粉进行观察检测，得出：淀粉颗粒为具有光滑表面的、大小约为5-18μm、的不均一的椭圆状的物质，其糊化温度为73.1-77.9-85.0℃。李新华等人以银杏果为研究对象，选择银杏果淀粉、玉米淀粉和马铃薯淀粉为比较对象，来探究三者之间的性质差异，通过研究发现：其中，马铃薯的各项指标都是最高的，无论是透明度还是膨胀度还是溶解度，次之是银杏果淀粉，再次之是玉米淀粉，另外，因银杏果淀粉较为特殊，若受到介质或浓度的影响，其粘度也会间接增大或减小。

2.2.2  银杏果蛋白质

黄文等人在研究白果蛋白质的分离、纯化、理化特性的过程中，其选用对象为产自于江苏市区，泰兴盛产白果，最为普遍使用的方式莫过于两种，其一是盐溶，其二是盐析，之所以这样做，主要还是因为这样可以更好的保证蛋白质含量充足，通过对提取出的蛋白质进行测定分析，得出结论，即白果中确实含有7.93%的蛋白质，在这些蛋白质中，含有42%的水溶性蛋白，其余就是盐溶性蛋白，另外也包含一定数量的难溶蛋白、醇溶蛋白等等。其中，白果清蛋白是从水溶性蛋白中提取出来的一类具有明显生物活性的蛋白。其抗氧化活性比球蛋白显著，能够有效增强人体的免疫功能。在银杏果中，蛋白质的含量不高，但是其中氨基酸的组成丰富。张凤梅等人在研究白果中清蛋白、球蛋白的功能性过程中，其选用的研究对象为银杏果实，使用的研究方法与黄文等人相同，研究发现，不论是在乳化能力、乳化稳定性方面，还是在蛋白黏度方面，白果球蛋白都比白果清蛋白强。

2.2.3  银杏果油

邓乾春等人采用不同的方法去研究白果油中不饱和脂肪酸的含量，经实验得出，选用索氏提取法技术，得到了91.59%的不饱和脂肪酸，79.85%的亚油酸和油酸；通过采用萃取法，所获得充足含量的白果油，其中包含亚油酸和不饱和脂肪酸，依次占比率为七成和九成左右，在进行相互对比发现，通常情况下，所占比率中，无论是亚麻酸还是油酸等都几乎高于其余油酸，另外，降低血脂和血压等等都可以服用一定的亚油酸，其大有裨益，同时毒杀癌细胞培养物也有一定的作用。银杏酸1997年，银杏酸开始被单独分析，直到现在也是一直在被研究分析。银杏酸是一种水杨酸衍生物，也是白果的主要活性成分。银杏酸可以抑制肿瘤生长增殖、转移，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，最终来达到抗肿瘤作用。除此之外，它也能够抵抗病毒，抑制细菌生长，消除炎症、解决过敏问题。同时它也是白果的毒性物质之一。它具有致敏性、致突变、胚胎毒性。经研究得到，银杏酸可以改变机体细胞免疫状态，来激发过敏机制，以达到解决过敏问题的效果。

2.2.4  银杏果多糖

多糖在银杏果中含量为3.08%。杨强等人围绕白果多糖进行研究，研究方法为热水浸提法提取多糖，在经过一系列操作后，大孔树脂会因受到Sevag除蛋白的影响，精制多糖就会被提取出来，主要也是为了更直观的看到具体组成结构，经过对紫外、红外、单糖结构分析得到结论，即：葡萄糖、半乳糖和木糖是多糖的单糖结构，在分析过程中也没有发现花色苷，关于银杏果多糖，其本质上属于含α-糖苷键的吡喃糖。多种自由基都可以被银杏果多糖清除，这也体现出来了多糖的抗氧化能力。陈群等人对银杏果进行热水提取，对提取到的多糖进行乙醇沉淀，除蛋白，乙醇分级分离，最终得到纯化多糖，经过分析发现，白果多糖是由D-甘露糖组成的匀多糖。

2.2.5  银杏果色素

在白果中，所蕴含高含量的胡萝卜素，其中成分包含α胡萝卜素、叶黄质等等，总共含量大约在4.89μg/g左右，β胡萝卜素对人体的健康有利，主要可以提高自身营养，并也具备一定的抗氧化作用，呈现于橘黄色，现在已广泛应用于医药、保健品、食品添加剂及化妆品等行业。陈悦娇等人选择白果作为研究对象，在进行研究过程中，主要采用的是薄层层析-分光光度法，这一方法的试验可以得知β胡萝卜素的所占含量，其大约为21-24μg/g。除胡萝卜色素外，也含有维生素E。

3  实验部分

3.1  实验材料和仪器

3.1.1  实验材料

实验所需材料如表3.1所示。

表3.1实验材料

3.1.2  实验仪器

实验所需仪器如表3.2所示。

表3.2实验仪器表

3.2  实验方法

3.2.1  银杏果多糖含量的测定

在试验过程中主要采取蒽酮硫酸法的方式，主要是因为蒽酮硫酸法中，在融合戊糖基、已糖和已糖醛酸后，蒽酮会产生化学反应，其具体就是溶液染色，逐渐显示蓝绿色，若含量约在620nm，那就可以获得最大吸收。

3.2.2  葡萄糖标准曲线的制定

1.葡萄糖标准溶液

称取已在80℃烘箱中烘干至恒重的葡萄糖100㎎，并按照一定数量，将葡萄糖放入至容量瓶中，切莫要注意一定要100毫升，之后再准确的刻制相应所放置的蒸馏水含量，再从中提取10毫升的溶液，经过定容后就可以获取标准溶液的数值，即0.1mg/ml，再按照相应的提取溶液毫升，依次放置于容量瓶中，从高至低依次排列为0毫升，1毫升，2毫升，3毫升，4毫升，6毫升和8毫升，分别标记为1-7号。

2.蒽酮试剂的配制

天平精准称取0.2g蒽酮，将其与100ml浓硫酸混合放置于烧杯中。在配制蒽酮试剂时，要严格遵守先蒽酮后硫酸的顺序，在缓慢加入硫酸的过程中，要借用玻璃棒进行搅拌。新鲜的蒽酮硫酸试剂是黄色透明的，如果在空气中放置太久，蒽酮在硫酸环境中，结构会被破坏，就不能检验多糖含量，因此，实验中需要的蒽酮试剂要及时配制，不能够久置，

3.标准曲线的绘制0号管内投放于一定数量的蒸馏水，正常情况下是5毫升，在与水充分溶解后，随后就可以投放蒽酮试剂，其含量10ml0.2%就足够，并进行摇晃，最后再进行加热，加热时间可控制在10分钟以内。

从1号瓶内，用工具吸取一定数量的溶液，即1毫升足够，与4ml蒸馏水一同加入1号试管，随后加入10ml0.2%的蒽酮试剂，在冰水浴中摇荡均匀，最终在沸水浴中放置10min;从2号容量瓶中吸取1ml溶液，转移至2号试管，再加入一定数量的蒸馏水，4毫升即可，经过水浴溶解后就可以再次加入蒽酮试剂，10毫升即可，再进行摇晃，加热十分钟就可以结束，以此类推，3-7号试管重复以上操作步骤。将0号试管溶液加入到一个比色皿中，另一个比色皿分别加入1-7号试管溶液，采用不同的两个比色皿，依次都加进紫外分光光度，并按照相同波长，再开始吸光度试验，其中，X轴所对应的是浓度标识，y轴对应的是吸光度标识，绘制葡萄糖的标准曲线。

3.2.3  多糖含量的测定

取出测试溶液并根据上文中所示的步骤得到试管对应的吸光度。通过采用试验的方法，在回归方程中也要加进吸光度数值，从而得出最为具体的浓度含量，并根据以下公式的计算方式，科学准确的得到多糖提取率。

3.2.4  银杏果的预处理

1.预处理流程

银杏果→恒温烘干→粉碎过筛→回流脱脂→洗涤干燥→脱脂银杏果粉

2.预处理

取银杏果，将其放在70℃条件下恒温干燥，随后充分粉碎之后过70目筛，用纸槽将过筛后的银杏果粉转移到500ml圆底烧瓶中，再量取180ml的乙醇溶液与银杏果粉混合，同时搭建好回流装备，并在烧瓶里加入沸石，调整好温度，在水浴锅中回流搅拌2h,回流结束后待圆底烧瓶冷却至室温，对所得到的沉淀物进行抽滤，得到的滤液倒入废液缸，随后，对滤渣依次进行无水乙醇洗涤、过滤、通风干燥操作，最后得到脱脂的银杏果粉。

3.2.5  银杏果多糖提取过程

本实验采取的是热水浸提法。称取经过预处理之后的银杏果粉2g,将脱脂银杏果粉与一定体积的蒸馏水进行混合，在特定温度下浸取一段时间，将圆底烧瓶中残留溶液进行过滤，取滤液，按照方法进行吸光度的测定。

3.2.6  单因素实验的设计

在进行实验时，将蒸馏水作为溶剂，将多糖的提取率作为衡量指标。在不同的条件下，最终得到的多糖产率是不同的。水浴温度，浸取时间，料液比，过滤次数,浸取次数等因素的改变都会对最终结果产生影响。结合实际情况，具体以三大因素作为试验对象，其一是水浴温度，其二是浸取时间，其三是料液比，在通过试验后可以科学的计算出最有利的试验方法和条件。

1.水浴温度单因素试验

称取5份脱脂的银杏果粉2g，与50ml蒸馏水一起加入烧杯中，提前将水浴锅分别加热到5℃、65℃、75℃、85℃、95℃，将烧杯放入水浴锅内，浸取2h。在浸取过程中，注意及时进行摇晃，使银杏果粉和蒸馏水充分融合。2h后，对得到的提取液进行抽滤，用蒸馏水将滤液定容至100ml，取1ml溶液和4ml蒸馏水，加入到对应试管，按照一定数量的蒽酮含量，即10ml 0.2%足够，再进行均匀晃动，随后就可以加热，加热时间可控制在十分钟以内，最后在设定波长为620nm的紫外分光光度计中测定吸光度。

2.浸取时间单因素试验

称取5份脱脂的银杏果粉2g，与50ml蒸馏水一起加入烧杯中，提前将水浴锅加热到88℃，将烧杯放入水浴锅内，浸取时间分别为2h,3h,4h,5h,6h。在浸取过程中，注意及时进行摇晃，使银杏果粉和蒸馏水充分融合。时间结束后，对得到的提取液进行抽滤，加入一定数量的溶液，依次取出1毫升左右的溶液在不同的试管内，同时也要在各个试管融入蒸馏水，其含量4毫升即可，再经过水浴后，融入10毫升的蒽酮含量，再进行均匀晃动，加热时间同样也要控制在10分钟以内，当其处于620nm时就可以科学的计量出吸光度数值。

3.料液比单因素试验

称取5份脱脂的银杏果粉2g，分别与30,40,50,60,70ml蒸馏水一起加入圆烧杯中，相当于料液比分别为1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，提前将水浴锅加热到88℃，将烧杯放入水浴锅内，浸取时间2h。在浸取过程中，注意及时进行摇晃，使银杏果粉和蒸馏水充分融合。2h后，对得到的提取液进行抽滤，将滤液定容到100ml容量瓶中，各自吸取1ml加入对应的试管，并加入4ml蒸馏水，在冰水浴中加入10ml 0.2%的蒽酮试剂，充分摇荡后，沸水浴处理10min,在620nm处测定吸光度。

3.2.7  正交试验的设计

在进行提取多糖试验的过程中，主要采用的是热水浸提取法，主要也是为了测试其是否属于更好的试验方法，在经过单因素试验后，主要针对于三个不同因素进行试验，其一是水浴度，其二是浸取时间，其三是料液比，主要试验方案如下可以看出。

表3.3正交试验设计表

表中A1、A2、A3分别为单因素实验确定水浴温度的最佳条件，另外确定浸取时间的更好条件因素也包括三种，依次对应的是B1，B2，B3，C1，C2，C3就是对应的最佳的料液比试验因素。

4  结果与讨论

4.1  葡萄糖标准曲线的绘制

按照所述方法配制葡萄糖溶液，并且进行吸光度的测定。以葡萄糖浓度为0，加入蒽酮硫酸的试剂为参比，测定其在620nm的吸光度，数据如表4.1所示。

表4.1不同浓度葡萄糖的吸光度值

最终绘制出的标准曲线如图4.1所示。

图4.1葡萄糖的标准曲线

葡萄糖浓度(X)与620nm下的吸光度(Y)的回归方程为：y=18.904x+0.0162，R2=0.9961，因为R2接近于1，也因此得出结论：在此范围内，吸光度与葡萄糖的浓度之间线性关系良好。

4.2  单因素对多糖提取率的影响实验

4.2.1  水浴温度对多糖提取率的影响

按照进行实验后，整理相关数据，计算出最终得提取率，，并绘制出合适的结果曲线图。结果如图4.2所示。

图4.2水浴温度对多糖提取率的影响

由图4.2可以看出，水浴温度在55℃~85℃之间，水浴温度越高，多糖提取率越高；在85℃之后，逐渐趋于平缓。这种情况的出现可能是因为不同的温度，对多糖溶出速率的改变程度不一样。为了更好的确定最优的银杏果实多糖提取工艺，进行正交实验的水浴温度是：75℃、85℃、95℃。

4.2.2  浸取时间对多糖提取率的影响

按照进行实验后，可以得出准确的吸光度数值，若想要科学的计算出葡萄糖浓度，那就可以介入吸光度，在回归方程中采用公式计算法，计算出具体可提取多少含量的多糖数值，X轴对应的是浸取时间，Y轴则对应的是提取率，基于此进行数据分析。结果如图4.3所示。

图4.3浸取时间对多糖提取率的影响

由图4.3可以看出，在5h之前，多糖提取率与浸取时间有良好的正线性关系；5h后，随着浸取时间增加，多糖提取率反而有下降的情况出现。这种情况出现，当浸取时间增加到一定程度后，温度还有一些外界因素会促进其他物质的溶出速率。综合效率和成本等因素，所以我们选择浸取时间为3h、4h、5h进行正交试验。

4.2.3  料液比对多糖提取率的影响

按照进行实验后，将测量的吸光度代入回归方程，得到葡萄糖浓度，按照进行实验后，将测量的吸光度代入回归方程，得到葡萄糖浓度，按照具体的公式计算法，科学准确的计算出提取含量，X轴对应料液比，Y轴对应提取率，并进行数据分析。结果如图4.4所示。

图4.4料液比对多糖提取率的影响

根据上图中数据可以清楚的看出，料液比若未高于1:30，也未低于1:15，那与料液比和提取率的关系就是正数，在料液比含量不断提高的同时，提取率会逐渐减少，从而得出，其比率为1:25、1:30、1:35。

4.3  正交试验

根据设计表格中数据开始实施正交试验，下表所显示的就是不同的水平因素，在通过试验后就可以得出下表4.2内的结果数据。

表4.2正交试验不同的水平因素

表4.3正交试验结果表

表4.3数据显示：R3>R1>R2，换而言之，就是料液比、水浴温度、浸取时间三个因素对于银杏果实多糖提取率的影响中，料液比更胜一筹，次之为水浴温度，最后是浸取时间，对所研究的进行了结论论述：1:30的料液比，在88℃在浸取5h，这种试验方式与其余相比，热水浸提法是更好、更有效的试验条件，从而可以提取二成以上的多糖。

5  结论

在以水浴温度为条件的试验过程中，可得出可影响多糖提取的论证结果：若温度控制在不高于85摄氏度，也不低于55摄氏度，水浴温度的不断提高，多糖提取率也会随之提，在85℃之后，逐渐趋于平缓。所以参与正交试验的水浴温度为75℃、85℃、95℃。2、通过研究浸取时间对多糖提取率的影响得出：在5h之前，多糖提取率与浸取时间有良好的正线性关系；5h后，随着浸取时间增加，多糖提取率反而有下降的情况出现。所以参与正交试验的浸取时间为3h、4h、5h。3、根据分析和探索发现，在以料液比作为条件的试验过程中，所得出的结论是：若料液比控制在未高于1:30，也未低于1:15，那么，提取率若越来越高，则表明料液比也会越来越高，但若超出1:30后，那就会呈现负相关关系。所以参与正交试验的料液比为1:25、1:30、1:35，最后通过正交试验来确定利用热水浸提法属于最有效的试验条件，其中，水浴温度要控制在85摄氏度左右，浸取时间要控制在5小时左右，料液比要控制在1:30，在这样的配比条件下，可从中提取2.21%的多糖率。

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