手足口病的PCR检测

手足口病的PCR检测

潘利英

内江市妇幼保健院 四川 内江 641000

对于手足口病的准确和迅速的诊断以及疾病的控制和治疗非常重要。在手足口病的诊断中，聚合酶链反应（PCR）技术发挥着关键作用。PCR技术通过检测病毒的核酸序列，可以准确、敏感地确定手足口病的存在与否，并区分不同的病毒血清型。目前，我国对手足口病进行检测，通常采用聚合酶链式（PCR)结合Taqman荧光探针技术，对人粪便和咽拭子样本中C4亚型EV71型、CA16型及其他型（如CA2、4、5、、7、9、10、和CB1、2、3、4、5等）肠道病毒鉴别检测。

一、我国手足口病原谱现状

在我国手足口病（HFMD）的致病血清型包括柯萨奇病毒（Coxsackievirus, CV)A组4~7、9、10、16型和B组1~3、5型，埃可病毒(Echovirus)的部分血清型和肠道病毒71型（Enterovirus A71, EV-A71)等，其中以CV-A16和EV-A71最为常见，重症及死亡病例多由EV-A71所致。

不同时期和地区的HFMD病原谱可能存在差异，这部分是由于肠道病毒的流行规律，另一部分可能受到近年EV71疫苗应用的影响。在过去的20年中，HFMD在亚太地区频繁爆发，严重影响儿童的生命健康。曾经，肠道病毒71型是导致HFMD危重症和死亡的主要病原体。然而，随着肠道病毒的不断变化，非EV71等其他肠道病毒引起的HFMD的比例显著增加。这意味着HFMD的病原谱正在发生变化，除EV71外的其他肠道病毒也开始成为引起HFMD的重要病原体。这一变化可能对疫苗的研发和防控策略产生影响，需要进一步的研究和监测来了解病原谱的动态变化，以便更好地应对HFMD的流行和控制。

二、手足口病PCR检测的原理

手足口病PCR检测是一种基于聚合酶链反应（PCR）技术的分子诊断方法，旨在检测手足口病毒的核酸序列。该方法通过扩增病毒的特定DNA或RNA片段，从而实现对手足口病毒的快速、准确的检测。PCR检测的原理基于DNA的复制过程，它涉及三个主要步骤：变性、引物结合和延伸。

变性：样本中的核酸（DNA或RNA）被暴露在高温条件下，使其双链解开，变成单链。

引物结合：在PCR反应体系中加入两个特异性引物，它们能够与手足口病毒的核酸序列互补配对。这两个引物分别位于目标序列的起始和终止位置，使得在PCR反应中只扩增目标序列。

延伸：加入DNA聚合酶酶和四种核苷酸，使引物结合到目标序列上，并在每个引物的3'末端引发DNA链的合成。这样，通过不断循环变性、引物结合和延伸步骤，可以在短时间内扩增目标序列的数量。

PCR反应进行多个循环后，扩增的DNA片段数量呈指数级增加。最终的PCR产物可以通过凝胶电泳等方法进行分析和检测。如果样本中存在手足口病毒的核酸序列，PCR反应将产生与目标序列相对应的特定片段，从而确认手足口病毒的存在。

PCR检测的优势在于其高度敏感性和特异性，可以检测到手足口病毒的存在即使病毒含量很低。此外，PCR方法还可以进行定量分析，确定病毒的负荷水平。然而，PCR检测也存在一些限制，对实验条件和技术操作的要求较高，如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。

三、手足口病PCR检测的关键步骤

1.采集标本。从患者口腔、咽喉、病损处或粪便中采集样本。常用的样本包括咽拭子、咽部漱口液、病损组织或疱液、粪便等。

2.提取核酸。将标本放入特定的试剂中，通过机械或化学方法，将病毒的核酸从细胞或其他物质中分离出来。

3.反转录（如为RNA病毒）：对RNA病毒进行反转录反应，将RNA转录为相应的DNA。这一步骤利用反转录酶（Reverse Transcriptase）将RNA作为模板合成相应的互补DNA链。

4.PCR反应设置：准备PCR反应体系，包括引物（特异性识别手足口病毒的DNA或RNA序列的短链核酸片段）、DNA聚合酶、核苷酸和缓冲液等。引物的选择十分关键，应确保其特异性，只能与手足口病毒的目标序列互补配对。

5.PCR扩增：将样本核酸加入PCR反应体系，并进行多个循环的PCR扩增。每个循环包括变性、引物结合和延伸步骤，使目标序列的数量指数级增加。

6.PCR产物检测：对PCR扩增产物进行分析和检测。常用的方法包括凝胶电泳、荧光探针等。凝胶电泳可以检测扩增产物的大小和带型，从而确定手足口病毒的存在。

7.结果解读：根据PCR扩增产物的大小和特征，判断手足口病毒的阳性结果。通常，特定大小的扩增产物与特定的手足口病毒血清型相关。

四、手足口病PCR检测的注意事项和限制

手足口病（HFMD）PCR检测是一种常用的诊断方法，但在进行检测时需要注意以下几个事项和限制：

样本采集：正确的样本采集对于准确的PCR检测结果至关重要。通常，采集咽拭子、肛拭子或者口腔黏膜拭子样本，标本采集过程中注意无菌操作。

实验室条件：PCR检测需要在符合一定实验室标准的环境下进行，确保操作规范和结果的可靠性。遵循好实验室操作规范，防止交叉污染和假阳性结果的产生。

病毒变异：手足口病病毒具有较高的遗传变异性，不同血清型之间存在差异。因此，在设计PCR引物和探针时，需要考虑到不同血清型的病毒，以确保检测的覆盖范围和特异性。

检测灵敏度：虽然PCR检测对于手足口病病毒的敏感性较高，但仍存在一定的检测限制。低病毒载量样本可能导致假阴性结果，因此需要选择合适的PCR方法和优化实验条件，以提高检测的灵敏度。

结果解读：PCR检测结果需要由专业的实验室人员进行解读和判定。不同PCR方法和试剂盒可能存在差异，因此要注意根据具体试剂盒说明书进行结果的解读和判定。

总之，手足口病PCR检测在手足口病的病原学研究和临床诊断中具有重要意义。我们应当充分利用PCR技术的优势，结合其他检测手段，全面了解手足口病的病原谱和流行情况，以促进手足口病的预防、早期诊断和有效控制，保障公众的健康和安全。