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目的：灵芝孢子油毒理学安全性评价。方法：采用急性经口毒性试验、遗传毒性试验（细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验）、90天经口毒性试验。结果：在本试验条件下，灵芝孢子油雌、雄性小鼠急性经口毒性试验的LD50大于18.4g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；灵芝孢子油以3.33g/kg.bw、6.26g/kg.bw、9.20g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。结论：灵芝孢子油长期食用是安全的。
关键词：灵芝孢子油；急性毒性试验；遗传毒性试验；大鼠90天经口毒性试验
灵芝孢子油采用超临界二氧化碳流体萃取技术，完整保留萃取物的生物活性，萃取物无溶剂残留，是一种安全、环保的新型萃取技术[1]。陈玉秀等[2]以超临界CO2萃取而得的灵芝孢子油三个剂量连续给大鼠灌胃给药4个月及停药1个月，观察灵芝孢子油的长期毒性，结果灵芝孢子油长期用药的安全剂量建议为每日用量不大于0.42g/kg。赵安东等[3]观察2036灵芝孢子油软胶囊对大鼠产生的长期毒性反应及严重程度。根据成人用量和本品最大灌胃浓度，将大鼠分为3个剂量给药组和1个阴性对照组。连续口服26周，停药4周，进行一般情况观察，血常规、血清生化指标、脏器系数检查。结果给药组活动自如，外观、摄食和粪便等均未见异常，体质量增加；血清生化指标，心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脑、胸腺、睾丸、卵巢的脏器系数与对照组比无统计学意义；尸检主要脏器未见明显病理变化。结果表明2036灵芝孢子油软胶囊长期毒性实验未见异常反应，临床上用本品是安全可靠的，可长时间较大剂量服用。本文旨在对灵芝孢子油进行安全性毒理学评价。
1试验材料
1.1试验样品：灵芝孢子油是利用超临界CO2萃取技术从破壁灵芝孢子粉中提取制得的油状物，总三萜含量约20%，相对密度0.92g/ml。灵芝孢子油人体推荐剂量为2g/人/d，成人按60kg算，折合人体0.0333g/kg。
1.2试验动物和细胞：SPF级昆明种小鼠，SPF级SD大鼠；鼠伤寒沙门氏菌 TA1535、TA97、TA98、TA100、TA102，中国仓鼠肺（CHL）细胞株。
2方法与结果
2.1急性经口毒性试验
按GB15193.3-2014《食品安全国家标准 急性经口毒性试验》限量法进行试验，结果以18.4g/kg·bw剂量的灵芝孢子油经口染毒后，2周内未见动物死亡，也无明显的中毒症状或不良反应，即灵芝孢子油对雌、雄小鼠的急性经口LD50＞18.4g/kg·bw，判属实际无毒级别。
性别 | 动物数量/只 | 剂量 (g/kg·bw) | 初始体 重(g) | 中期体 重(g) | 末期体 重(g) | 死亡数 (只) | LD50 (g/kg·bw) | 结论 |
雄 | 10 | 18.4 | 20.9±0.5 | 31.4±1.4 | 35.0±2.1 | 0 | ＞18.4 | 实际无毒 |
雌 | 10 | 18.4 | 20.3±1.0 | 27.2±1.1 | 30.9±1.4 | 0 | ＞18.4 | 实际无毒 |
表1 灵芝孢子油对小鼠的急性经口毒性试验结果(
±s)
2.2 细菌回复突变试验
按GB15193.4-2014《食品安全国家标准 细菌回复突变试验》平板掺入法进行试验，结果无论试验加和不加S9，自发对照组每皿平均回变菌落数均在正常值范围内，而阳性对照组呈明显阳性反应，诱发的每皿平均回变菌落数均为自发对照组2倍以上。灵芝孢子油各剂量组呈阴性反应，平均回变菌落数均未超过自发对照组的1倍， 即灵芝孢子油无诱导试验菌株回复突变的作用。
表2 灵芝孢子油细菌回复突变试验结果（第一次）(±s)
组别 | 剂量µg/皿 | TA97 | TA98 | TA100 | TA102 | TA1535 | |||||
+S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | ||
灵芝孢子油 | 5000 | 130.1±8.0 | 130.8±8.1 | 30.1±5.4 | 27.5±3.3 | 139.8±7.9 | 147.4±13.7 | 278.1±10.4 | 302.1±18.6 | 26.1±3.0 | 25.8±3.3 |
1000 | 128.4±6.8 | 127.2±8.4 | 26.4±4.3 | 26.4±3.6 | 144.3±8.4 | 150.1±14.2 | 287.7±11.2 | 315.4±16.0 | 25.2±3.4 | 29.4±2.9 | |
200 | 126.3±6.3 | 133.3±9.6 | 27.8±3.5 | 26.7±3.0 | 140.1±6.8 | 145.5±13.5 | 281.4±12.0 | 303.2±18.7 | 24.8±3.8 | 24.7±3.0 | |
40 | 131.2±7.4 | 131.8±8.9 | 30.7±4.0 | 29.8±3.9 | 139.7±8.7 | 143.4±15.5 | 294.2±12.3 | 306.5±18.6 | 29.1±3.7 | 26.1±2.7 | |
8 | 127.1±9.2 | 130.4±9.5 | 29.8±3.7 | 25.1±4.4 | 142.0±7.3 | 146.1±16.2 | 296.5±11.1 | 307.6±16.5 | 25.5±3.3 | 25.9±2.3 | |
自发对照 | 128.8±8.0 | 131.0±8.7 | 28.9±4.9 | 27.6±5.5 | 130.2±8.0 | 144.3±17.0 | 288.9±13.8 | 305.7±17.8 | 26.2±2.9 | 24.8±2.0 | |
溶剂对照 | 125.5±7.5 | 127.5±7.8 | 27.4±3.8 | 24.8±3.8 | 131.4±7.0 | 147.2±16.7 | 290.8±13.9 | 307.9±16.5 | 24.8±3.5 | 26.0±2.4 | |
阳性对照 | 828.8±64.1 | 416.8±20.3 | 2775.4±106.3 | 203.4±20.2 | 2194.8±304.1 | 823.4±122.3 | 863.1±79.9 | 1527.4±124.1 | 231.4±22.2 | 622.1±49.9 | |
表3灵芝孢子油细菌回复突变试验结果（第二次）(±s)
组别 | 剂量µg/皿 | TA97 | TA98 | TA100 | TA102 | TA1535 | |||||
+S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | ||
灵芝孢子油 | 5000 | 120.1±8.3 | 124.1±9.3 | 32.2±2.9 | 31.4±4.3 | 131.4±9.3 | 135.5±7.1 | 294.8±19.9 | 304.8±13.1 | 24.4±2.9 | 22.4±2.0 |
1000 | 120.3±8.0 | 120.8±9.9 | 30.8±3.3 | 29.9±3.9 | 134.6±7.5 | 136.1±7.9 | 295.4±17.8 | 298.7±14.2 | 25.6±3.4 | 23.5±2.3 | |
200 | 119.4±8.4 | 121.4±8.6 | 32.3±3.6 | 31.2±4.2 | 132.0±8.4 | 136.4±7.3 | 290.1±18.6 | 305.4±12.5 | 23.3±3.0 | 21.4±2.1 | |
40 | 118.5±8.6 | 120.9±9.1 | 30.4±3.3 | 30.3±3.1 | 133.2±8.2 | 132.8±6.8 | 300.2±13.1 | 299.1±13.4 | 24.8±2.2 | 24.1±3.1 | |
8 | 117.8±7.8 | 122.1±8.8 | 31.8±3.0 | 29.8±4.0 | 130.8±7.3 | 136.2±9.0 | 294.6±15.7 | 300.2±14.6 | 23.4±2.1 | 20.8±2.9 | |
自发对照 | 121.4±7.9 | 125.0±9.0 | 32.0±3.1 | 31.4±3.4 | 131.3±8.9 | 137.6±6.9 | 302.5±16.3 | 299.6±13.3 | 24.5±3.3 | 22.6±3.0 | |
溶剂对照 | 120.3±8.0 | 123.4±9.5 | 31.5±3.7 | 30.8±4.5 | 135.7±9.1 | 131.1±5.4 | 294.7±16.2 | 302.3±14.7 | 25.7±2.0 | 23.3±3.3 | |
阳性对照 | 863.4±91.4 | 426.1±30.0 | 2598.1±173.1 | 188.8±21.8 | 2358.1±260.9 | 866.1±36.5 | 946.1±80.7 | 1526.1±81.9 | 216.8±25.8 | 560.8±57.0 | |
2.3 哺乳动物红细胞微核试验
按GB15193.5-2014《食品安全国家标准 哺乳动物红细胞微核试验》进行试验，结果阳性对照组雌、雄动物的微核率均显著高于阴性对照组(P<0.05)，灵芝孢子油各剂量组的微核率与阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05)， 表明灵芝孢子油在小鼠骨髓细胞微核试验中为阴性结果。
表4 灵芝孢子油哺乳动物红细胞微核试验结果
性别 | 剂量 | 动物数/只 | 细胞数/个 | 微核细胞数/个 | 微核率 | PCE（个）（ | PCE/200（ |
雄 | 10.0g/kg·bw | 5 | 2000×5 | 20 | 2.0±0.6 | 110.2±6.21 | 0.55±0.04 |
5.0g/kg·bw | 5 | 2000×5 | 17 | 1.7±0.5 | 102.4±5.84 | 0.51±0.04 | |
2.5g/kg·bw | 5 | 2000×5 | 16 | 1.6±0.7 | 108.2±6.47 | 0.54±0.03 | |
阴性对照组 | 5 | 2000×5 | 18 | 1.8±0.4 | 116.0±5.81 | 0.58±0.05 | |
环磷酰胺对照组 | 5 | 2000×5 | 220 | 22.0±4.5* | 112.3±6.07 | 0.56±0.03 | |
雌 | 10.0g/kg·bw | 5 | 2000×5 | 29 | 2.9±1.3 | 136.4±7.81 | 0.68±0.04 |
5.0g/kg·bw | 5 | 2000×5 | 28 | 2.8±1.1 | 130.2±7.23 | 0.65±0.03 | |
2.5g/kg·bw | 5 | 2000×5 | 21 | 2.1±1.0 | 134.8±7.18 | 0.67±0.07 | |
阴性对照组 | 5 | 2000×5 | 28 | 2.8±1.2 | 138.1±6.92 | 0.69±0.06 | |
环磷酰胺对照组 | 5 | 2000×5 | 313 | 31.3±3.0* | 128.6±6.86 | 0.64±0.05 |
注：“*”表示与阴性对照组比较，P<0.05。
2.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验
按GB15193.23-2014《食品安全国家标准 体外哺乳类细胞染色体畸变试验》进行试验，结果试验中加和不加S9时，阳性对照细胞染色体畸变率均显著高于阴性对照(P<0.05)，呈明显阳性反应。而灵芝孢子油各剂量组细胞染色体畸变率与阴性对照比较无显著性差异(P>0.05)，为阴性结果。表明灵芝孢子油在本实验条件下，未引起体外培养的CHL细胞染色体畸变。
表5 灵芝孢子油体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果
受试物 | 剂量mg/mL | 计数中期相细胞数（个） | 畸变率（%） | ||
+S9 | -S9 | +S9 | -S9 | ||
灵芝孢子油 | 1.25 | 100 | 100 | 3 | 2 |
2.50 | 100 | 100 | 3 | 1 | |
5.00 | 100 | 100 | 2 | 2 | |
阴性对照 | 0 | 100 | 100 | 2 | 1 |
环磷酰胺阳性对照 | 15µg/mL | 100 | - | 35* | - |
丝裂霉素C阳性对照 | 0.8µg/mL | - | 100 | - | 30* |
注：“*”表示与阴性对照组比较，P<0.05。
2.5 90天经口毒性试验
按GB15193.13-2015《食品安全国家标准 90天经口毒性试验》进行试验，以灵芝孢子油3.33、6.26、9.20g/kg·bw 3个剂量组(相当于人体推荐剂量2g/人/d的100、188、276倍)进行90天经口毒性试验，结果各组动物生长发育良好，各项监测指标均正常，各剂量组动物大体解剖未见异常，未发现与灵芝孢子油有关的病理组织学改变。具体结果分析如下：
2.5.1 大鼠体重、进食量、食物利用率：各剂量组大鼠在试验期内总体生长状况良好，未见明显中毒体征，无动物死亡。各剂量组动物的每周体重、体重总增重、总进食量和总食物利用率与阴性对照组比较差异均无统计学意义。
2.5.2 眼部检查结果：在试验前和试验结束时，对高剂量组和阴性对照组大鼠进行眼部角膜、晶状体、球结膜和虹膜检查，未见明显眼部病理变化。
2.5.3 血液学检查结果：由表6、表7可见，大鼠血常规各项指标均在本实验室正常值范围内，与阴性对照组比较均无统计学意义。
表6 灵芝孢子油对大鼠血常规的影响(±s)
性别 | 剂量组 | 白细胞(×109/L) | 中性粒细胞(%) | 淋巴细胞(%) | 中间细胞(%) |
雄 | 9.20g/kg·bw | 14.55±2.02 | 81.51±3.88 | 12.88±2.50 | 11.41±2.88 |
6.26g/kg·bw | 14.56±2.10 | 81.62±4.17 | 12.65±1.61 | 11.53±3.37 | |
3.33g/kg·bw | 13.91±2.07 | 83.70±3.96 | 12.20±2.01 | 11.90±2.34 | |
阴性对照组 | 14.57±2.09 | 83.35±3.29 | 12.11±1.72 | 11.44±2.61 | |
雌 | 9.20g/kg·bw | 11.13±2.15 | 87.42±2.62 | 10.83±2.23 | 9.54±1.39 |
6.26g/kg·bw | 10.80±2.01 | 86.51±3.21 | 10.96±2.74 | 9.33±1.66 | |
3.33g/kg·bw | 11.06±2.23 | 87.70±2.53 | 10.39±2.01 | 9.72±1.83 | |
阴性对照组 | 10.91±2.16 | 84.81±2.09 | 10.47±2.97 | 9.52±1.64 |
表7 灵芝孢子油对大鼠血常规的影响(±s)
性别 | 剂量组 | 血红蛋白(%) | 红细胞计数(×1012/L) | 红细胞压积(%) | 血小板计数(×109/L) | 凝血酶原时间(s) | 活化部分凝血活酶时间(s) |
雄 | 9.20g/kg·bw | 134.66±6.34 | 9.70±0.15 | 40.06±1.90 | 818.86±55.68 | 14.75±0.43 | 17.72±2.99 |
6.26g/kg·bw | 134.06±6.61 | 9.58±0.13 | 38.45±1.82 | 805.14±65.37 | 14.93±0.48 | 17.35±2.61 | |
3.33g/kg·bw | 136.57±6.15 | 9.73±0.16 | 39.44±1.56 | 817.46±88.44 | 14.65±0.43 | 17.84±2.64 | |
阴性对照组 | 138.68±6.68 | 9.85±0.19 | 39.71±1.34 | 808.86±71.19 | 14.85±0.61 | 17.58±2.68 | |
雌 | 9.20g/kg·bw | 136.27±6.31 | 9.35±0.13 | 38.66±1.49 | 778.06±97.19 | 13.97±1.31 | 15.84±1.13 |
6.26g/kg·bw | 136.87±6.68 | 9.39±0.11 | 38.57±1.58 | 795.75±95.87 | 13.78±1.35 | 15.02±1.30 | |
3.33g/kg·bw | 137.07±7.01 | 9.49±0.12 | 38.80±1.83 | 767.91±82.04 | 14.03±1.72 | 15.36±1.19 | |
阴性对照组 | 136.89±6.45 | 9.53±0.15 | 38.73±1.24 | 789.72±99.65 | 13.98±1.11 | 15.27±1.28 |
2.5.4 血液生化检查结果：由表8、表9可见，大鼠各项生化指标均在本实验室正常值范围内，与阴性对照组比较均无统计学意义。
表8灵芝孢子油对大鼠血液生化指标的影响(±s)
性别 | 剂量组 | 丙氨酸氨基转移酶(U/L) | 门冬氨酸氨基转移酶(U/L) | 碱性磷酸酶(U/L) | 谷氨酰转肽酶(U/L) | 尿素(mmol/L) | 肌酐(μmol/L) | 血糖(mmol/L) | |||
雄 | 9.20g/kg·bw | 63.9±9.2 | 136.5±26.4 | 96.65±12.98 | 1.91±0.74 | 7.78±1.15 | 77.3±1.3 | 10.61±1.48 | |||
6.26g/kg·bw | 67.8±10.6 | 137.2±27.5 | 95.07±13.91 | 1.97±0.73 | 7.84±1.27 | 78.0±1.6 | 10.45±1.59 | ||||
3.33g/kg·bw | 65.2±9.8 | 138.6±22.2 | 98.93±11.32 | 2.01±0.86 | 7.64±1.08 | 77.5±1.5 | 10.32±1.92 | ||||
阴性对照组 | 66.8±10.5 | 137.5±21.4 | 98.38±11.17 | 1.96±0.83 | 7.88±1.19 | 77.7±1.2 | 10.27±1.56 | ||||
雌 | 9.20g/kg·bw | 63.2±10.6 | 119.3±19.5 | 82.20±17.56 | 2.60±0.65 | 8.89±1.35 | 74.4±3.4 | 10.13±1.27 | |||
6.26g/kg·bw | 60.8±9.8 | 121.9±14.4 | 81.49±13.00 | 2.69±0.64 | 8.65±1.06 | 73.8±6.8 | 10.26±1.26 | ||||
3.33g/kg·bw | 62.1±10.4 | 122.2±17.0 | 82.98±15.36 | 2.67±0.73 | 8.59±1.03 | 75.4±5.9 | 10.85±1.75 | ||||
阴性对照组 | 60.8±9.6 | 120.3±17.9 | 81.28±17.67 | 2.61±0.74 | 8.80±1.07 | 74.3±4.3 | 10.42±1.39 | ||||
表9灵芝孢子油对大鼠血液生化指标的影响( | |||||||||||
性别 | 剂量组 | 总蛋白(g/L) | 白蛋白(g/L) | 总胆固醇(mmol/L) | 甘油三酯(mmol/L) | 钾(mmol/L) | 钠(mmol/L) | 氯(mmol/L) | |||
雄 | 9.20g/kg·bw | 59.95±1.81 | 35.32±1.11 | 1.70±0.13 | 1.14±0.52 | 4.68±0.21 | 136.25±0.96 | 99.55±1.12 | |||
6.26g/kg·bw | 59.26±1.85 | 35.49±1.01 | 1.77±0.20 | 1.10±0.63 | 4.65±0.25 | 136.70±1.16 | 99.27±1.07 | ||||
3.33g/kg·bw | 60.20±1.71 | 35.21±1.18 | 1.71±0.19 | 1.02±0.43 | 4.77±0.29 | 136.27±1.09 | 99.02±0.93 | ||||
阴性对照组 | 60.91±1.66 | 35.95±1.09 | 1.74±0.16 | 1.08±0.54 | 4.78±0.31 | 136.60±1.02 | 99.04±0.91 | ||||
雌 | 9.20g/kg·bw | 63.21±1.51 | 37.32±1.09 | 1.93±0.53 | 0.83±0.37 | 4.58±0.65 | 136.97±1.06 | 100.63±1.38 | |||
6.26g/kg·bw | 62.58±1.62 | 37.76±1.38 | 1.94±0.63 | 0.86±0.55 | 4.57±0.70 | 136.63±1.09 | 100.13±1.19 | ||||
3.33g/kg·bw | 63.80±1.82 | 37.61±1.06 | 1.90±0.64 | 0.87±0.51 | 4.39±0.64 | 136.08±0.91 | 100.92±1.24 | ||||
阴性对照组 | 63.26±1.91 | 37.42±1.05 | 1.92±0.54 | 0.82±0.42 | 4.55±0.63 | 136.28±0.93 | 100.93±1.17 | ||||
2.5.5 尿液检查结果：雌、雄动物尿液外观正常，尿蛋白、葡萄糖和潜血结果均为阴性。
2.5.6 病理学检查结果：
2.5.6.1大体解剖：肉眼观察各组动物外观、体表、皮肤均未见异常，无被毛脱落、皮肤破损等，肛周无分泌物，胸腹腔膜光滑，未见出血点及积气、积液；各组动物主要脏器位置正常，未见明显病变。灵芝孢子油对大鼠脑、心脏、胸腺、肾上腺、肝脏、脾脏、肾脏、睾丸、附睾、子宫、卵巢的重量和脏体比均无影响，与阴性对照组比较，差异均无统计学意义。
2.5.6.2组织病理学检查：通过大体解剖和镜下观察，高剂量组与阴性对照组比较，未见明显由灵芝孢子油引起的脏器的典型病理学改变和特异性损伤改变。
3 结论
参照《食品安全性毒理学评价程序》（GB15193.1-2014）对灵芝孢子油进行安全性毒理学评价，采用限量法，在本试验条件下灵芝孢子油雌、雄性小鼠急性经口毒性试验的LD50大于18.4g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；灵芝孢子油以3.33g/kg.bw、6.26g/kg.bw、9.20g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。为灵芝孢子油应用于保健食品提供了安全性依据。
参考文献
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[2]陈玉秀,张德波.灵芝孢子油长期毒性试验研究[J].生物技术世界,2013,(2):69-70.
[3]赵安东,金翠英,钟志强,等.2036灵芝孢子油软胶囊长期毒性实验研究[J].汕头大学医学院学报,2011,24(3):138-140+144.
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