硫酸氨基葡萄糖胶囊微生物限度方法学验证

硫酸氨基葡萄糖胶囊微生物限度方法学验证

羊政祥    通讯作者：杨芳琼、邢菲菲

海南林恒制药股份有限公司，海南 海口 570216

摘要：依据2020年版《中国药典》四部（通则1105）（通则1106），验证硫酸氨基葡萄糖胶囊需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数及控制菌（大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌）的微生物限度检查法。确定所采用的微生物限度检查法适合于硫酸氨基葡萄糖胶囊需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数的测定以及相关控制菌（大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌）的检查。以文件形式记录所确认硫酸氨基葡萄糖胶囊微生物限度检验方法的要求及合格标准，证实并描述该检验方法合理，可靠[1]。

关键词：硫酸氨基葡萄糖胶囊需氧菌总数霉菌及酵母菌总数肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌

前言：硫酸氨基葡萄糖胶囊具有缓解关节疼痛和抗炎的功效与作用，具体疗程需要根据患者的病情来定。硫酸氨基葡萄糖胶囊一般用于治疗原发性及继发性骨关节炎，可以有效缓解关节的疼痛。其有效成分是硫酸氨基葡萄糖，而硫酸氨基葡萄糖是软骨基质聚多糖链和关节液聚氨基葡萄糖的正常构成成分，能够刺激软骨细胞合成生理性的聚氨基葡萄糖和蛋白聚糖，刺激黏膜细胞合成透明质酸。抑制破坏软骨的胶原酶等酶，防止破坏组织的超氧自由基的产生，抑制溶酶体酶的活性。此外，它具有温和的抗炎作用。因此，硫酸氨基葡萄糖胶囊被广泛应用于原发性和继发性骨关节炎的临床治疗，包括髋关节和膝关节骨关节炎、类风湿性关节炎等。

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一、硫酸氨基葡萄糖胶囊微生物限度检查

1.培养基、试剂及菌种[2]

2.验证内容

2.1需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备

（1）分别接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成含菌量不超过104cfu/ml的菌悬液，备用。

（2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基，20～25 ℃培养2～3天，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成含菌量不超过104cfu/ml的菌悬液，备用。

（3） 接种黑曲霉菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，20～25℃培养5～7天，加3～5ml 含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，洗下霉菌孢子，吸取孢子悬液，用含0.05%(ml/ml) 聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成含菌量不超过104cfu/ml的菌悬液，备用。

2.2需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数检查方法验证（1）-平皿法[4]、[5]

（1） 试验组：各取1:10、1:100的供试品溶液9.9ml及含菌量不超过104cfu/ml的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆、白色念珠菌、黑曲霉菌菌菌悬液各0.1ml分别置于已灭菌的试管内，混匀，各取1ml置于已灭菌的平皿中（直径为90mm），加入15～20ml胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基(培养基温度不得过45℃，每个稀释级每株试验菌至少制备2个平皿)，混匀，待培养基凝固后，在30℃～35℃下培养3天和在20℃～25℃下培养5天观察结果，取平均值计算菌落数。

（2） 菌液组：各取9.9ml稀释剂及含菌量不超过104cfu/ml的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌悬液各0.1ml分别置于已灭菌的试管内，混匀，各取1ml置于已灭菌的平皿中（直径为90mm），加入15～20ml胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基(培养基温度不得过45℃，每株试验菌至少制备2个平皿)，混匀，待培养基凝固后，在30℃～35℃下培养3天和在20℃～25℃下培养5天观察结果，取平均值计算菌落数。

（3） 供试液对照组：各取1:10、1:100的供试品溶液9.9m及0.1ml稀释剂置于已灭菌的试管内，混匀，取1ml置于已灭菌的平皿中（直径为90mm），加入15～20ml胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基(培养基温度不得过45℃，每个稀释级至少制备2个平皿)，混匀，待培养基凝固后，在30℃～35℃下培养3天和在20℃～25℃下培养5天观察结果，取平均值计算菌落数。

（4） 阴性对照组：取1ml稀释剂置于已灭菌的平皿（直径为90mm），加入15～20ml胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基(培养基温度不得过45℃，平行制备2个平皿)，待培养基

凝固后，在30℃～35℃下培养3天和在20℃～25℃下培养5天观察结果。

（5） 结果判定

以上实验培养到期后，对各平皿中的菌数进行计数，3次独立的平行试验中，阴性对照组应无菌落生长，若出现菌落生长情况，视为本次验证失败，查找原因后重新验证。试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组的比值是否在0.5-2.0范围内，如果是，则适用性试验结果满足要求，如果不是，则应采用培养基稀释法、薄膜过滤法等方法或联合使用这些方法，消除供试品的抑菌性，并重新进行方法验证。[2]

2.4、控制菌检查方法验证-常规法（大肠埃希菌）[3]

（1）试验组：取1:10供试液10ml及含菌量不超过100cfu/ml的菌悬液1ml置于已灭菌的试管内，混匀，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，在30～35℃下培养18～24h。取1ml胰酪大豆胨液体培养基培养物接种至100ml麦康凯液体培养基中，在42～44℃下培养24～48h。取麦康凯液体培养基培养物在麦康凯琼脂平板上划线进行培养，在30～35℃下培养18～72h。观察麦康凯琼脂平板上的菌落形态，应与药典描写的形态一致。

（2）阴性对照组：取稀释液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，在30～35℃下培养18～24h。取1ml胰酪大豆胨液体培养基培养物接种至100ml麦康凯液体培养基中，在42～44℃下培养24～48h。取麦康凯液体培养物在麦康凯琼脂平板上划线进行培养，在30～35℃下培养18～72h。

（3）阳性对照组：取含菌量不超过100cfu/ml的菌悬液加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，在30～35℃下培养18～24h。取1ml胰酪大豆胨液体培养基培养物接种至100ml麦康凯液体培养基中，在42～44℃下培养24～48h。取麦康凯液体培养基培养物在麦康凯琼脂平板上划线进行培养，在30～35℃下培养18～72h。观察麦康凯琼脂平板上的菌落形态，应与药典描写的形态一致[4]。

（4）结果判断

阴性对照试验中，在麦康凯琼脂平板上应无菌落生长，若有菌落生长，视为试验失败。应查明原因重新进行方法适用性检查。

阳性对照组、试验组在麦康凯琼脂上应有菌落生长，应按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查.若试验组未检出试验菌，应采用中和法、薄膜过滤法等方法或联合使用这些方法，以消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

2.5控制菌检查方法验证-常规法（乙型副伤寒沙门菌）

（1）试验组：取供试品10g及含菌量不超过100cfucfu/ml的菌悬液1ml，混匀，置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，在30～35℃下培养18～24h。取上述培养物0.1ml，接种至10mlRV沙门菌增菌液体培养基中，30～35℃培养18～24h。取RV沙门菌增菌液体培养基培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上，30～35℃培养18～48h。观察木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上的菌落形态，应与药典描写的形态一致。

（2）阴性对照组：胰酪大豆胨液体培养基100ml，在30～35℃下培养18～24h。取上述培养物0.1ml，接种至10mlRV沙门菌增菌液体培养基中，30～35℃培养18～24h。取RV沙门菌增菌液体培养基培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上，30～35℃培养18～48h。

（3）阳性对照组：取含菌量不超过100cfu/ml的菌悬液1ml，置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，在30～35℃下培养18～24h。取上述培养物0.1ml，接种至10mlRV沙门菌增菌液体培养基中，30～35℃培养18～24h。取RV沙门菌增菌液体培养基培养物接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上，30～35℃培养18～48h。观察木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上的菌落形态，应与药典描写的形态一致。

（4）结果判断

阴性对照试验中，在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应无菌落生长，若有菌落生长，视为试验失败。应查明原因重新进行方法适用性检查。

阳性对照组、试验组在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上是否检出菌落，若检出试验菌应按此供试液制备法和控制菌检查法进行该供试品的该控制菌检查；若未检出试验菌，应采用中和法、薄膜过滤法等方法或联合使用这些方法，以消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。[4]

3、实验结果     产品微生物限度检查验证记录（需氧菌总数） 1/1

产品微生物限度检查验证记录（需氧菌总数）             2/2

产品微生物限度检查验证记录（霉菌及酵母菌总数）             3/3

产品微生物限度检查验证记录（大肠埃希菌）4/4

1、菌落计数  目的为确定验证用菌悬液浓度在100cfu/ml以内

2、试验组、阳性对照组、阴性对照组培养

3、结果判定

产品微生物限度检查验证记录（乙型副伤寒沙门菌）5/5

1、菌落计数  目的为确定验证用菌悬液浓度在100cfu/ml以内

2、试验组、阳性对照组、阴性对照组培养2/2

3、结果判定

4、验证结论[6]

通过以上的验证，确定该检验方法适合于硫酸氨基葡萄糖胶囊的微生物限度检验。

按《非无菌产品微生物限度检查法：微生物计数法操作规程》、《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法操作规程》及《非无菌产品微生物限度标准》测定。

本品需氧菌总数不得过1000cfu/g，霉菌和酵母菌总数不得过100cfug/g，每1g不得检出大肠埃希菌。

若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定。若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。

结语：我国开展药品微生物限度检验始于1972年。《中国药典》1995年版正式收载了微生物限度检查法，但是标准尚未载入药典。2000年版药典增收了以剂型载入的微生物限度标准。该标准正确有效地规范了药品生产检验和监督的程序，为国家药品监督部门的管理、药品检验工作提供了可靠的依据。《中国药典》2010年版在微生物限度检查方法上增加了微生物限度检查的方法学验证内容。方法学验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药典中所收载的何种试液制备方法、何种测定方法及确定的检测系统是否使用于该供试品的检验,能否真实的反映供试品受微生物污染的情况。只有通过方法学验证,才能确定供试品的检验条件和方法,保证微生物限度检查方法的科学性和检验结果的准确性。

参考文献

[1] 柳莹,相坤.非无菌药品的微生物限度检查概述[1].世界最新医学信息文摘,2018,18(02):34-35.DO1:10.19613/j.cnki.1671-3141.2018.02.019.

[2] 蔡芷荷，卢勉飞，叶青华，等.念珠菌显色培养基检测效果初步评价[J].中国卫生检验杂志，2013，23(6):1465-1468，1472.

[3] 王琳琳,丁安伟,耿敬军.药品微生物学检查方法学验证执行状况分析[U].医药导报,2007(05):569-571.

[4] 马仕洪，刘鹏，杨利红，王知坚，孙雪奇,林丽英,胡昌勤.药品微生物限度检查方法适用性试验中加菌方式的实验研究[J].药物分析杂志，2018,38(5): 877-882.DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.05.20.

[5] 庞云娟,樊文研,刘康连,梁洁.药品微生物限度检查方法学验证的研究进展[1].中成药，2017,39（10）：2137-2140

[6] 薛坤.我国微生物限度检查方法验证研究概况(综述).中国城乡企业卫生，2008（02）：91-93.

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