苦瓜提取物安全性试验研究

苦瓜提取物安全性试验研究

林云邵刚

重庆三峡医药高等专科学校  重庆 404120

【摘要】目的进行苦瓜提取物安全性毒理学试验研究。方法采用限量法的雌、雄性大鼠急性经口毒性试验，遗传毒性试验（细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验），90天经口毒性试验，致畸试验。结果在本试验条件下，苦瓜提取物雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于20.0g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；苦瓜提取物以0.75g/kg.bw、1.50g/kg.bw、2.25g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围内；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。苦瓜提取物对大鼠未见母体毒性、胚胎毒性和致畸性。结论苦瓜提取物长期食用是安全的。

【关键词】苦瓜提取物；安全性

苦瓜（学名：Momordica charantia），又名凉瓜、癞瓜、半生瓜，起源于东印度，是一种葫芦科植物，广泛栽培于热带、亚热带、温带等地区，品种繁多。苦瓜的果肉、种子、茎叶等部位均被认为具有潜在的应用价值。苦瓜传统的营养价值包括：清热解毒、降血糖、养颜嫩肤、养血滋肝等；药用价值包括清热解毒，明目等；食用价值包括作为蔬菜食用、苦瓜保健饮料、茶饮品等。

历年来，苦瓜被作为一种药食两用植物，富含多糖、多肽、多酚、皂苷及多种生物活性成分。近几十年来，科学家们致力于研究苦瓜调脂降糖、抗氧化、抗炎、免疫调节、保护肝和神经组织等生理功能[1]。

1试验材料

1.1试验药物苦瓜提取物，苦瓜经10倍量65%乙醇回流提取2次，每次2h，过滤、合并滤液、浓缩、喷雾干燥得苦瓜提取物，得率约8%，人体推荐剂量0.45g/人/d。

1.2实验动物SPF级昆明种小鼠，体重25～35g，SPF级健康离乳SD大鼠，体重180～220g，雌雄各半。

2 试验方法

2.1急性经口毒性试验：采用限量法，选用SPF级健康离乳SD大鼠20只，雌雄各半。急性经口毒性剂量为20.0g/kg.bw。给样后连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。期间每周称量一次体重。

2.2 细菌回复突变试验：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五株菌株进行试验。首次试验采用平板掺入法、证实试验采用平板掺入法。采用β-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝S9作为体外代谢活化系统。首次试验剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性突变剂对照，通过首次试验确定受试物的溶解度与细菌毒性。根据首次试验结果设定证实试验的剂量为5000μg/皿、1000μg/皿、200μg/皿、40μg/皿和8μg/皿。样品置于0.103Mpa条件下高温灭菌20min，在无菌条件下，称量受试样品并配制成溶液，受试样品用无菌水配制成50mg/mL，即高剂量组。首次试验将高剂量组用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成15、5、1.5、0.5mg/mL4个剂量组，验证试验将高剂量组用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成10、2、0.4、0.08mg/mL4个剂量组。

2.3 哺乳动物红细胞微核试验：选用SPF级昆明种小鼠50只，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为5个组，每组10只，雌雄各半。小鼠灌胃体积按20mL/kg.bw计算，故最高剂量设10.0g/kg.bw，中、低剂量设5.0g/kg.bw、2.5g/kg.bw，同时设溶剂(蒸馏水)对照组，40mg/kg·bw环磷酰胺为阳性对照组，采用30h给受试物法两次给受试样品间隔24h，第二次给受试样品后6小时处死动物，取胸骨常规制片、镜检。每鼠计数2000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计。每鼠计数200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数（NCE），并计算嗜多染红细胞与总红细胞比值（PCE/RBC）。

2.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验：选用中国仓鼠肺（CHL）细胞株。据细胞毒性和受试样品溶解情况，选择5000、2500、1250µg/mL3个剂量组进行染色体畸变试验。在无代谢活化条件下，采用直接致突变物丝裂霉素做为阳性对照物，浓度为0.25μg/mL；在有代谢活化条件下，采用间接致突变物环磷酰胺做为阳性对照物，浓度为15μg/mL。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿中，放CO2培养箱内培养。试验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9mix（不加S9mix

时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3h。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用PBS溶液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱,于24h收获细胞。于收获前4h，加入细胞分裂中期阻断剂秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL。收获的细胞经消化、低渗、固定后滴片、染色以备阅片。在油镜下阅片，每一个剂量组应分析不少于100个分散良好的中期分裂相。

2.5 90天经口毒性试验：选用体重80±5gSPF级健康离乳SD大鼠80只，雌雄各半，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为4个组，每组10只，雌雄各半。受试样品按人体推荐剂量的100、200、300倍即0.75g/kg.bw、1.50g/kg.bw、2.25g/kg.bw给予，同时设溶剂对照组，每日经口灌胃一次，连续90d。每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量。计算动物增重、摄食量、食物利用率等，在试验前和试验结束时，至少对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。若发现高剂量组动物有眼部变化，则应对所有动物进行检查。测定血常规、生化等血液学指标。大鼠在试验结束时进行尿液常规检查，实验结束将动物处死并进行大体解剖，肉眼观察有无异常，称量并计算脏体比值，进行主要组织病理学检查。

2.6 致畸试验：对受孕SD大鼠于受孕第6天-第15天每天灌胃分别给予0.75g/kg.bw、1.50g/kg.bw、2.25g/kg.bw剂量的苦瓜提取物，阳性对照组给予0.28g/kg.bw的阿司匹林，于孕第20天处死孕鼠，解剖观察孕鼠胚胎毒性指标及胎鼠生长发育指标。

3 结果

3.1 大鼠急性经口毒性试验：在14d观察期内，雌、雄大鼠外观均正常，四肢活动正常，无死亡。剖检未出现肉眼可见病变。获得雌雄大鼠苦瓜提取物急性经口毒性试验LD50＞20.0g/kg.bw。根据急性毒性分级标准，将其判定为无毒级物质。

3.2遗传毒性试验：细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性。

3.3 90天经口毒性试验：以0.75g/kg.bw、1.50g/kg.bw、2.25g/kg.bw剂量的苦瓜提取物经灌胃给予大鼠，连续90天。各组动物生长发育、活动均正常，大鼠毛发光润，摄食、饮水、粪便均正常。无中毒表现和死亡。与阴性对照组相比，各剂量组动物每周体重、体重增加量、进食量和食物利用率均无统计学差异（P>0.05）；各剂量组动物总体重增加量、总进食量和总食物利用率均无统计学差异（P>0.05）。未发现高剂量组和对照组动物有眼部异常变化；各剂量组尿常规指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、氯、钾、钠的水平等血生化指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组雌雄大鼠大体解剖观察均未见异常改变。大体解剖观察未发现与受试样品有关的组织病理学改变。

3.4 致畸试验：见表1，阳性对照组孕鼠活胎数显著低于阴性对照组（P<0.05），死胎及吸收胎的发生率显著高于阴性对照组（P<0.05）；各剂量组孕鼠着床数、活胎数、死胎及吸收胎发生率与阴性对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。

表1 苦瓜提取物对孕鼠胚胎毒性指标的影响（x±s）

阳性对照组实验末期体重、总增重及子宫连胎重均显著低于阴性对照组（P<0.05），胎鼠体重、体长显著减少（P<0.05），前囟宽、头骨、胸骨、肋骨、四肢骨、脊骨、骨盆骨发育不全的异常率显著高于阴性对照组（P<0.05）；阳性对照组部分胎鼠出现明显的外观、内脏、骨骼畸形。各剂量组孕鼠体重、增重、子宫连胎重、胎鼠体重、体长、胎鼠外观、骨骼及内脏发育情况与阴性对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。

4结论根据GB 15193.1-2014《食品安全国家标准食品安全性毒理学评价程序》，本研究针对苦瓜提取物长期食用安全性进行了研究，采用限量法，在本试验条件下

苦瓜提取物雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于20.0g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；苦瓜提取物以0.75g/kg.bw、1.50g/kg.bw、2.25g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。苦瓜提取物以0.75g/kg.bw、1.50g/kg.bw、2.25g/kg.bw的剂量进行致畸试验，结果苦瓜提取物对大鼠未见母体毒性、胚胎毒性和致畸性。由此证明苦瓜提取物长期食用是安全的。

参考文献

[1]董英, 钱希文, 白娟等. 苦瓜改善胰岛素抵抗功能与作用机制研究进展[J].食品科学, 2013, 34(21): 369-374.