筛选低致瘤性MDCK细胞的方法

筛选低致瘤性MDCK细胞的方法

王福慧  王斐  任新颖  张嵘*

辽宁科瑟生物技术有限公司 110000；沈阳药科大学 110016

摘要：目的：MDCK细胞是从犬肾中提取的贴壁细胞，在疫苗生产中具有重大作用，然而，其高致瘤性是流感疫苗生产中的主要争议。本实验目的为筛选单克隆细胞系中低致瘤性的细胞系。方法：利用建立的单克隆细胞系，用软琼脂克隆实验筛选低致瘤性的MDCK细胞。结果：通过显微镜下观察细胞克隆数，选择出致瘤性较低的MDCK细胞系。结论：获得致瘤性较低的MDCK细胞系，为后续制备流感疫苗提供基础。

关键词：MDCK细胞；致瘤性；细胞培养。

前言：Madin-Darby犬肾上皮(MDCK)细胞是一种永生化细胞系，由于MDCK细胞具有流感病毒易感染、易培养、增殖快及病毒不易变异等特点，被认为是最适合于甲型和乙型流感病毒疫苗生产的重要细胞系之一，通过细胞克隆技术和选择低致瘤性细胞用于流感疫苗的生产，可以很好地提高疫苗的生产效率和安全系数。

1 材料与方法

1.1 MDCK单克隆细胞 实验室利用有限稀释法筛选获得MDCK单克隆细胞（共8支）。原贴壁MDCK细胞由美国ATCC提供，ATCC编码CCL-3，批号70040764；viability 94%、VCD 2.4*106/ml;

1.2 主要试剂 0.25%胰蛋白酶（批号：2184134）及MEM基础培养基（批号：2641712）自美国GIBCO公司购买；胎牛血清（批号：202314100）自太原润生生物公司购买；0.02%EDTA（批号：102491206）自美国SIGMA公司购买；琼脂糖（批号：122015）自西班牙NOVON购入；青霉素-链霉素(批号：23285738)自北京兰杰柯有限公司购入；2倍MEM:按配方称取对应重量MEM溶解于相应的超纯水中（加入20%胎牛血清、1%双抗）；台盼蓝（批号：20230708）自飞净生物科技有限公司购入。

1.3 主要仪器 二氧化碳培养箱（型号：QP-160）来自山东博科科学仪器有限公司；生物安全柜（型号：HR30-IA2）来自青岛海尔生物医疗股份有限公司；细胞计数仪(型号：Counistar Mira FL)来自上海睿钰生物科技有限公司；倒置显微镜（型号：DSZ2000X来自庆光电技术有限公司；低速台式离心机（型号：TDZ-WS）来自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；细胞培养瓶(T25)来自康宁生命科学(吴江)有限公司。

1.4 细胞的复苏：从液氮中取单克隆MDCK细胞置于37℃水中快速溶解，转移至含有20%胎牛血清的MEM培养基，在37℃、5%CO2条件下培养6-24小时。弃去原培养液，更换为含有10%胎牛血清的MEM培养基继续培养24-48h，观察细胞形态并及时换液。同时复苏MRC-5，Hela细胞。

1.5 细胞的消化：细胞生长到致密单层时，弃去原培养基，加入5ml胰酶（含1% EDTA）消化至细胞完全按脱落，1600rpm离心10分钟（MRC-5和Hela细胞1200rpm离心10min），弃上清。用MEM培养基重悬。使用台盼蓝对细胞进行染色并计数，用MEM培养基根据细胞数量将细胞稀释至1*103ml备用。

1.5 软琼脂克隆实验：配制1.2%，0.7%浓度的琼脂糖溶液，灭菌后置于45℃水浴保温。将1.2%琼脂糖溶液与2倍MEM培养基1:1混合，按每孔2ml加入至6孔板中，待1.2%琼脂冷却定型。按1:1比例将0.7%琼脂糖与2倍MEM混合均匀，加入最终稀释浓度的细胞悬液（每孔0.02ml）,每孔2ml加入到底层琼脂已经成型的6孔板中，每个细胞平行实验三孔。待琼脂完全凝固后每孔加0.5ml培养基。在37℃、5%CO2条件下培养14天。每3-5天对6孔板进行补液。14天后弃去6孔板中剩余培养液，使用PBS润洗三遍，每孔加入0.5ml甲醇固定30min。固定后弃去甲醇，再次使用PBS清洗3次，加入结晶紫溶液染色20min，吸出染色剂再用PBS清洗三次。在倒置显微镜下进行计数,计算克隆形成率。

2 结果

2.1 不同致瘤性细胞的复苏与培养:

阴性对照MRC-5细胞成纤维状，阳性对照Hela细胞镜下观察呈不规则多边形，铺路石状。MDCK单克隆细胞培养48h镜下观察状态良好，细胞轮廓清晰，密度基本为70%左右。长满单层后分布均匀，为典型的多角上皮样细胞形态。

2.1 MDCK细胞活率:

MDCK单克隆细胞株培养消化后，细胞活率，最低85.19%，最高99.18%，平均92.35%。

2.2 克隆计数

软琼脂培养2周后将培养板置于倒置显微镜下计数克隆数，每个细胞集落含50个或大于50个细胞为1个克隆。可以在阳性对照和部分单克隆MDCK细胞中发现阳性克隆。其中MDCK-H3，MDCK-F10镜下观察到阳性克隆数量较少且克隆直径较小，为筛选得到的低致瘤性的细胞系。

表一：软琼脂实验阳性克隆数

3 讨论

MDCK通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞，由于MDCK细胞对多种不同流感病毒敏感且生产效率高，被公认是最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的细胞系之一。然而，使用MDCK细胞制备流感疫苗存在一个主要争议，即其高致瘤性。为了保证疫苗的安全性，开发低成瘤性MDCK细胞系不仅可以减轻下游纯化工艺的难度，还可以从根本上降低以其生产流感疫苗后的接种风险。

本实验首先将使用有限稀释法制备的单克隆细胞进行培养，并编号为MDCK-F2、MDCK-F1、MDCK-D8、MDCK-H3、MDCK-F3、MDCK-G3、MDCK-E8、MDCK-F10，实验结果显示，单克隆细胞在培养72小时状态良好，基本形成单层。进行软琼脂实验时，适当调整细胞密度、降低抗生素使用量，从而完善实验条件。经过计算阳性克隆数量及与对照品比较，筛选得到的低成瘤性细胞系为MDCK-H3、MDCK-F10。以上研究显示，MDCK细胞是一种具有低致瘤潜力的细胞系，利用本实验研究方法可以解决动物源MDCK细胞致瘤性这一问题，提高流感疫苗的生产效率及安全性，进而预防和控制流感的大面积流行。

参考文献

[11] 马桂兰.低成瘤性MDCK单克隆细胞系的建立,成瘤性分析及应用研究[J].[2024-01-17].

作者简介：第一作者 王福慧 1999年1月23日 女 黑龙江省哈尔滨市 汉 硕士研究生 辽宁药科大学 研究方向:生物学
第二作者 王斐 1963年1月24日男吉林省长春市汉本科高级医学生物学工程师辽宁科瑟生物技术有限公司研究方向:生物制品及疫苗

第三作者 任新颖 女 河北省邯郸市 汉

第四作者 张嵘 女 辽宁省沈阳市 汉