裂蹄木层孔菌中不同溶剂提取物对体外抗肿瘤活性

裂蹄木层孔菌中不同溶剂提取物对体外抗肿瘤活性

刘瑛琳，许梅花（通讯作者）

延边大学医学院,吉林 延吉 133002

摘要：目的对裂蹄木层孔菌不同溶剂提取物及其抗氧化活性进行了研究。方法 依次用石油醚、三氯甲烷、甲醇萃取和水提物浓缩后醇沉提取粗多糖。采用DPPH 自由基法、羟自由基法和超氧阴离子自由基法，分别研究裂蹄木层孔菌不同溶剂提取物的抗氧化活性。结果 裂蹄木层孔菌不同溶剂提取物和粗多糖均具有一定的抗氧化活性。结论 裂蹄木层孔菌对荧光素酶的保护效果与浓度相关。

关键词：裂蹄木层孔菌；不同溶剂；提取物；活性

真菌被用于在我国的应用具有悠久的历史，裂蹄木层孔菌(Phellinus rimosus)为多孔菌科、木层孔菌属的一种药用真菌，又名针裂蹄、裂蹄针层孔菌等。子实体多年生，硬木质、无柄，扁半球形至马蹄形或不规则形。生于阔叶树的树干上及枯立木上，可引起白色腐朽。裂蹄木层孔菌主要化学成分是子实体、菌丝体以及发酵液中的胞外多糖，此外还有黄酮及其衍生物、香豆素类、甾醇类化合物。据报道裂蹄木层孔菌具有抗炎、增强免疫调节［1-3］、抗肝纤维化［4］、降血糖［5］的作用。对裂蹄木层孔菌的子实体、菌丝体或由发酵液所获得的水提物和多糖类物质进行了生物活性的研究，发现具有抗炎、抗氧化、抑制肿瘤生成、保肝[6]和化症散结药、健脾止泻[7]等作用。本文以裂蹄木层孔菌石油醚、氯仿、甲醇提取和物粗多糖为研究对象，探讨该提取物在体外对HRE-Hep3B细胞的增殖抑制作用。

1 材料和对象

1.1材料

裂蹄木层孔菌购自延吉市长白山特产品经营部，由吉林省延边特产研究所金成一鉴定为多孔菌科裂蹄木层孔菌子实体。裂蹄木层孔菌子实体置烘箱50～55℃ 烘至8成干，然后剪成小碎块，再于60℃ 烘24h后粉碎过60目筛、备用。

1.2 药品与试剂

Lipofectamine®2000转染试剂；胰蛋白酶；细胞培养基；DMSO；CoCl2；MTT试剂。

1.3 细胞

pGL3-HRE-Luciferase质粒；Hep3B细胞由延边大学药学院提供。

1.4 主要仪器

LDZ5- 2型离心机，北京医用离心机厂；LD24—1.8型低速自动平衡离心机，北京雷勃尔离心机有限公司；SW-CJ-1F超净工作台，万净集团安泰公司；ESJ60-4电子天平，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；恒温循环水浴箱，北京医疗设备厂；酶标仪，Sunrise 公司。培养箱；96孔板；摇床；Promega GloMax 96 微孔板发光检测仪。

2 方法

2.1 裂蹄木层孔菌提取物和粗多糖的制备

2.1.1 甲醇提取物:准确称取10.0g裂蹄木层孔菌干粉，加入100ml石油醚回流提取两次，3h/次,浓缩蒸馏石油醚，低温烘干得提取物0.1083g。

2.1.2 氯仿提取物；准确称取10.0g裂蹄木层孔菌干粉，加入100ml氯仿回流提取两次，3h/次,浓缩蒸馏氯仿，低温烘干得提取物0.1479g。

2.1.3 粗多糖的提取：准确称取10.0g裂蹄木层孔菌干粉，加入100ml蒸馏水回流提取两次，3h/次,过滤，合并母液。浓缩蒸馏水，当溶液残留15-20ml时加入95%乙醇250ml,过夜，过滤，干燥得裂蹄木层孔菌的粗多糖0.7311g。

2.2 双荧光素酶报告基因检测

用Lipofectamine®2000转染试剂将pGL3-HRE-Luciferase质粒转染Hep3B细胞，培养24小时。然后将转染过的HRE-Hep3B细胞按1×104密度接种于96孔板，待细胞贴壁后处理不同浓度的样品（终浓度为0.4μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml）培养半小时，之后用CoCl2处理16h。弃去细胞培养基，每孔加入80μl细胞裂解液，室温摇床上裂解1h，收集细胞用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。

2.3 MTT检测

细胞进入对数生长期后，用0.25%胰蛋白酶消化，以每孔1×104密度接种于96孔板，放入培养箱（37℃、5%CO2、正常氧浓度和饱和湿度）中培养，待细胞贴壁后按样品浓度（终浓度为0.4μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml）处理细胞，DMSO作为阴性对照。培养24小时，每孔加入MTT试剂（5mg/ml）10µl，培养箱中培养4小时，终止培养，弃去培养基，每孔加入100μl DMSO，570nm酶标仪检测各孔吸光度[8]。

3 结果和分析

3.1  双荧光素酶报告基因检测HRE-Hep3B结果

3.1.1 裂蹄木层孔菌的石油醚、氯仿、甲醇提取物和粗多糖对HRE-Hep3B细胞的抑制效果

表1显示，裂蹄木层孔菌的石油醚、氯仿、甲醇提取物和粗多糖浓度对HRE-Hep3B细胞活抑制效果很大。将不同浓度的石油醚提取物作用于HRE-Hep3B细胞24 h 后，利用双荧光素酶检测。实验结果显示当石油醚、氯仿和甲醇提取物浓度为0.4μg·ml

-1时对上述癌细胞既有明显的抑制作用，而粗多糖浓度为0.4μg·ml-1时抑制作用反而下降。当石油醚和氯仿提取物浓度为0.4μg·ml-1时抑制率分别为84.3%，54.9%，甲醇提取物浓度为0.4μg·ml-1时抑制率为84.1%；   

表１　裂蹄木层孔菌提取物对HRE-Hep3B细胞的抑制效果（ｘ±ＳＤ，ｎ＝５）

当粗多糖浓度增加抑制率也跟随增加，当浓度增加到10μg·ml -1时对细胞增殖的抑制率为78.8% 。但添加了提取物的抑制率明显高于对照组。其中，不同浓度对荧光素酶抑制程度不同，浓度为石油醚、氯仿、甲醇的提取物浓度为0.4μg·ml-1时，抑制效果最佳。粗多糖中0.4μg·ml-1时最小。而添加0.4μg/ml裂蹄木层孔菌保活率在60-80%左右，裂蹄木层孔菌抑制作用使抑制率增加30-50%左右。

3.1.2裂蹄木层孔菌提取物和粗多糖对HRE-Hep3B细胞的增殖的影响

如图1所示，在正常氧的条件下，HIF1α的表达量很低，处理CoCl2后，即在缺氧条件下HIF1α的表达量上调约3.4倍。在1%O2条件下随着处理的样品浓度的递增，HIF1α的表达量呈现剂量性抑制。

图1  双荧光素酶报告基因检测各样品对HRE-Hep3B细胞中HIF1α表达的影响

20%O2为阴性对照组，1%O2为阳性对照组，不同浓度的样品在缺氧条件下培养细胞为药物组。

3.2  MTT法对各样品对裂蹄木层孔菌提取物对Hep3B细胞增殖的影响

如图2所示， Hep3B细胞与不同浓度的样品共培养24h后，随着样品浓度的递增，各样品对细胞的增值没有影响。

图2   各样品对Hep3B细胞增殖的影响

4 讨论

石油醚、氯仿、甲醇提取物浓度为0.4μg·ml-1时裂蹄木层孔菌对HRE-Hep3B细胞的抑制作用最佳，粗多糖浓度10.0μg·ml-1对HRE-Hep3B细胞的抑制作用最佳。表明裂蹄木层孔菌对荧光素酶的保护效果与浓度相关。实验表明，裂蹄木层孔菌提取物和粗多糖对HRE-Hep3B细胞的增殖有影响。在正常氧的条件下，HIF1α的表达量很低，但处理CoCl2后HIF1α的表达量上调。在1%O2条件下随着样品浓度的递增，HIF1α的表达量呈现剂量性抑制。MTT法测量裂蹄木层孔菌的提取物和粗多糖不同浓度的样品在Hep3B细胞共同培养24h后随着样品浓度的递增，各样品对细胞的增值没有影响。

参考文献

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[2]Huang HH.Pharmaceutical Cell Biology.Beijing: China Medical Science Press,2006．

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[5]You S,Han Z. Study on extraction technique of alkaloids from Pinellia ternata. J Gansu Lianhe Univ,2006,20:69-71.

[6]张问,焦燕,李航,等.裂蹄木层孔菌抗肿瘤作用及其机制研究[J].中草药,2011,42(10):2047-2050.

[7]刘云,胡姗姗,朱欣婷.裂蹄木层孔菌乙酸乙酯萃取物对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用研究[J].中国民族民间医药,2012,21(17):59-60.

[8]张文亮,王淑美,贾萍,等.祖师麻对巨噬细胞分泌VEGF和表达HIF-1a的影响[J],中药药理与临床,2007,23(2):39-40.

作者简介：

第一作者：刘瑛琳（2000-）女，蒙古族，籍贯-内蒙古自治区通辽市，延边大学医学院预防医学研究生，

Email:p454565@163.com.

通讯作者：许梅花（1978-），女，朝鲜族，籍贯-吉林省和龙市，延边大学医学院预防医学教研室教师，硕士，高级讲师,Email:2408729763@qq.com.