简介：摘要目的评价铁死亡在高脂高糖心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用。方法正常培养的H9c2心肌细胞，采用随机数字表法分为3组(n＝20)：对照组(C组)、高脂高糖-缺氧复氧组(HFHG+H/R组)和Ferrostatin-1+高脂高糖-缺氧复氧组(Fer-1+HFHG+H/R组)。采用高脂高糖处理12 h，随后缺氧4 h，复氧2 h的方法制备H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤模型。Fer-1+HFHG+H/R组在高脂高糖处理同时加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1，终浓度10 μmol/L。于复氧2 h时，采用CCK-8法检测细胞活力，2，4二硝基苯肼显色法检测上清液LDH活性，荧光探针DCFH-DA流式细胞术检测ROS活性，Western blot法检测心肌细胞长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、核受体共激活因子4(NCOA4)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达。结果与C组比较，HFHG+H/R组细胞活力降低，LDH活性、ROS活性、ACSL4和NCOA4表达水平升高(P<0.05)，GPX4表达差异无统计学意义(P>0.05)；与HFHG+H/R组比较，Fer-1+HFHG+H/R组细胞活力升高，LDH活性、ROS活性、ACSL4和NCOA4表达水平降低(P<0.05)，GPX4表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论铁死亡参与了高脂高糖心肌细胞缺氧复氧损伤的过程。

简介：摘要目的评价缺刻基因1(Notch1)/发状分裂相关增强子1(Hes1)信号通路在高糖心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用。方法取H9c2心肌细胞在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养、传代，采用随机数字表法分为6组(n＝12)：对照组(C组)用低糖培养基孵育72 h；缺氧复氧组(H/R组)用低糖培养基孵育72 h后，置于37 ℃、95%N2-5%CO2培养箱中缺氧24 h，然后立即置于37 ℃、95%O2-5%CO2培养箱中复氧6 h；缺氧复氧+Jagged-1组(H/R+J组)在低糖培养基中加入Notch1/Hes1信号通路特异性激动剂Jagged-1 5 μg/ml孵育72 h，然后进行缺氧复氧处理；高糖组(HG组)用高糖培养基(葡萄糖浓度33 mmol/L)孵育72 h；高糖+缺氧复氧组(HG+H/R组)用高糖培养基孵育72 h，然后进行缺氧复氧处理；高糖+缺氧复氧+Jagged-1组(HG+H/R+J组)用高糖培养基和Jagged-1 5 μg/ml共孵育72 h，然后进行缺氧复氧处理。于复氧6 h时，收集细胞培养液上清，测定SOD和LDH的活性，采用CCK-8法测定细胞活力，采用流式细胞仪测定细胞凋亡率，采用Western blot法检测Notch1、Hes1和c-caspase-3表达水平。结果与C组比较，H/R组、H/R+J组和HG组细胞活力和SOD活性降低，细胞凋亡率和LDH活性升高，H/R组和H/R+J组细胞Notch1、Hes1和c-caspase-3表达上调，HG组细胞Notch1和Hes1表达下调，c-caspase-3表达上调(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+J组细胞活力和SOD活性升高，细胞凋亡率和LDH活性降低，细胞Notch1和Hes1表达上调，c-caspase-3表达下调，HG+H/R组细胞活力和SOD活性降低，细胞凋亡率和LDH活性升高，细胞Notch1和Hes1表达下调，c-caspase-3表达上调(P<0.05)；与HG组比较，HG+H/R组和HG+H/R+J组细胞活力和SOD活性降低，细胞凋亡率和LDH活性升高(P<0.05)，HG+H/R组细胞Notch1和Hes1表达下调，c-caspase-3表达上调(P<0.05)；与HG+H/R组比较，HG+H/R+J组细胞活力和SOD活性升高，细胞凋亡率和LDH活性降低，细胞Notch1和Hes1表达上调，c-caspase-3表达下调(P<0.05)；与H/R+J组比较，HG+H/R+J组细胞活力和SOD活性降低，细胞凋亡率和LDH活性升高，细胞Notch1和Hes1表达下调，c-caspase-3表达上调(P<0.05)。结论Notch1/Hes1信号通路激活是高糖心肌细胞缺氧复氧损伤的内源性保护机制。

简介：摘要目的探讨蛋白激酶Cβ2 (protein kinase Cβ2, PKCβ2）在高糖与缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation, HR）诱导的心肌细胞焦亡中的作用。方法将培养的H9c2心肌细胞按随机数字表法分为5组（每组6孔）：低糖组（LG组）、低糖缺氧/复氧组（LG+HR组）、高糖组（HG组）、高糖缺氧/复氧组（HG+HR组）、高糖缺氧/复氧+PKCβ2抑制剂CGP53353 （1 µmol/L）治疗组（HG+HR+CGP组）。采用三气培养箱（5%CO2、94%N2、1%O2）缺氧4 h，正常氧浓度复氧2 h构建细胞HR模型，细胞计数试剂盒（cell counting kit-8, CCK8）检测细胞存活率，ELISA法检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）水平，Western blot法检测细胞PKCβ2及焦亡相关蛋白Nod样受体蛋白-3 (Nod-like receptor pyrin domain3, NLRP3）、IL-1β、半胱氨酸蛋白酶-1 (caspase-1）表达水平，JC-1染色评估H9c2细胞线粒体膜电位水平。结果与LG组比较，HG组、LG+HR组、HG+HR组细胞存活率明显降低而LDH释放水平明显增加（P<0.05），同时伴随PKCβ2活化及NLRP3、IL-1β、caspase-1表达上调（P<0.05）；与HG组比较，HG+HR组LDH释放水平增加，细胞存活率明显降低（P<0.05），JC-1单体细胞百分比及磷酸化PKCβ2 [phospho-PKCβ2 （Ser660）, P-PKCβ2]蛋白、NLRP3、IL-1β、caspase-1表达上调（P<0.05）；与LG+HR组比较，HG+HR组LDH释放水平增加，细胞存活率明显降低（P<0.05），P-PKCβ2表达明显增加，NLRP3、IL-1β、caspase-1表达上调（P<0.05）。与HG+HR组比较，HG+HR+ CGP组细胞存活率明显增加，LDH释放水平、JC-1单体细胞百分比、P-PKCβ2、NLRP3、IL-1β、caspase-1表达下调（P<0.05）。结论选择性抑制PKCβ2过度活化可减轻心肌细胞高糖HR性损伤，其机制可能与降低细胞焦亡水平及减轻线粒体损伤有关。

简介：摘要目的评价高糖致心肌微血管内皮细胞损伤时沉默信息调节因子1(SIRT1)与信号转导子及转录激活子3(STAT3)乙酰化的关系。方法培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞，取正常对数期生长的细胞，采用随机数字表法分为3组(n＝24)：对照组(C组)、高糖组(HG组)和高糖+SIRT1激动剂SRT1720组(HG+SRT组)。心肌微血管内皮细胞以每孔2×105个/ml的密度接种于6孔板或96孔板中培养，当细胞密度达50%时，将HG组和HG+SRT组更换为含1%胎牛血清和1%双抗的葡萄糖浓度为33 mmol/L的高糖培养基，同时HG+SRT组加入20 μmol/L SRT1720，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。采用CCK-8法检测细胞活力，测定细胞SOD活性，ELISA法检测上清液LDH、IL-6和TNF-β水平，Western blot法检测SIRT1、乙酰化STAT3(ac-STAT3)及磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达水平。结果与C组比较，HG组和HG+SRT组细胞活力和SOD活性降低，上清液LDH、IL-6和TNF-β水平升高，细胞SIRT1表达下调，ac-STAT3和p-STAT3表达上调(P<0.05)；与HG组比较，HG+SRT组细胞活力和SOD活性升高，上清液LDH、IL-6和TNF-β水平降低，细胞SIRT1表达上调，ac-STAT3和p-STAT3表达下调(P<0.05)。结论SIRT1可通过促进STAT3脱乙酰化，减轻高糖致心肌微血管内皮细胞损伤。

简介：摘要目的评价组蛋白去乙酰化酶3 (HDAC3)在原代大鼠心肌细胞高糖缺氧复氧损伤中的作用及其与自噬的关系。方法将1~3 d左右的新生SD乳鼠提取原代心肌细胞，铺板。按随机数字表法分为5组(n＝24)：对照组(C组，糖浓度5.5 mmol/L)、缺氧复氧组(H/R组)、高糖组(H组，糖浓度30 mmol/L)、高糖缺氧复氧组(HH/R组)和高糖缺氧复氧+HDAC3抑制剂RGFP966组(HH/R+RG组)。采用50%葡萄糖注射液制备高糖培养基(终浓度为30 mmol/L)。H/R组细胞置于低氧环境(5%CO2-0.9%O2-94.1%N2)中培养6 h，再置于常氧环境中复氧2 h制备心肌细胞缺氧复氧模型。HH/R+RG组于缺氧复氧前24 h加入RGFP966，终浓度10 μmol/L。于细胞复氧2 h时，采用CCK-8法检测细胞活力；ELISA法检测细胞上清LDH活性；自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染下共聚焦显微镜检测细胞自噬水平；Western blot法检测心肌细胞HDAC3、p62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的表达，计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。结果与C组比较，H/R组和H组心肌细胞活力降低，上清液LDH活性升高，H/R组自噬小体数增加，心肌细胞HDAC3表达上调，p62表达下调，LC3 Ⅱ/I比值升高，H组自噬小体数减少，心肌细胞HDAC3和p62表达上调，LC3 Ⅱ/I比值降低(P<0.05)；与H/R组比较，HH/R组心肌细胞活力降低，上清液LDH活性升高，自噬小体数量降低，HDAC3和p62表达上调，LC3 Ⅱ/I比值降低(P<0.05)；与H组比较，HH/R组心肌细胞活力降低，上清液LDH活性升高，自噬小体数量增加，HDAC3和p62表达上调，LC3 Ⅱ/I比值升高(P<0.05)；与HH/R组比较，HH/R+RG组心肌细胞活力升高，上清液LDH活性降低，自噬小体数量增加，HDAC3和p62表达下调，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值升高(P<0.05)。结论HDAC3表达上调参与了原代心肌细胞高糖缺氧复氧损伤的过程，与降低细胞自噬水平有关。

简介：摘要目的评价沉默信息调节因子3(SIRT3)过表达对高糖小鼠海马神经元缺氧复氧损伤的影响及其与超氧化物歧化酶2(SOD2)的关系。方法将正常培养的对数期HT22小鼠海马神经元，采用随机数字表法分为3组(n＝12)：高糖常氧组(HG组)、高糖+缺氧复氧组(HHR组)、高糖+缺氧复氧+SIRT3过表达组(HHR+SIRT3组)。3组神经元均在高糖培养基(葡萄糖浓度为50 mmol/L)中培养8 h建立高糖模型。HHR组和HHR+SIRT3组置于无糖缺氧环境中培养6 h后换高糖常氧培养24 h制备高糖缺氧复氧模型，HHR+SIRT3组转染SIRT3过表达慢病毒。采用CCK-8法检测神经元活力，流式细胞仪检测活性氧(ROS)含量，比色法测定线粒体MDA含量、SOD、过氧化氢酶(CAT)活性和ATP含量，JC-1探针检测线粒体膜电位(MMP)，Western blot法检测核呼吸因子1(NRF1)、线粒体转录因子A(TFAM)、SIRT3、SOD2以及乙酰化SOD2(ac-SOD2)的表达。结果与HG组比较，HHR组和HHR+SIRT3组神经元活力、SOD、CAT活性、ATP含量、MMP、NRF1、TFAM及SIRT3表达水平降低，ROS、MDA含量及ac-SOD2/SOD2比值升高(P<0.05)；与HHR组比较，HHR+SIRT3组神经元活力、SOD、CAT活性、ATP含量、MMP、NRF1、TFAM及SIRT3表达水平升高，ROS、MDA含量及ac-SOD2/SOD2比值降低(P<0.05)。结论SIRT3过表达可减轻高糖状态下小鼠海马神经元缺氧复氧损伤，机制与其激活SOD2去乙酰化有关。

简介：摘要目的评价自噬在右美托咪定减轻大鼠高糖离体心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用。方法正常培养的对数期大鼠H9c2心肌细胞，以1×106个/ml密度接种于6孔板，采用随机数字表法分为4组(n＝15)：对照组(C组)、高糖缺氧复氧组(HG+H/R组)、右美托咪定组(DEX组)和右美托咪定+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组(3-MA组)。细胞密度达到50%时，使用含1%胎牛血清+1%双抗的培养基孵育24 h。采用高糖培养基(糖浓度33 mmol/L)培养24 h，37 ℃下培养箱(95%N2+5%CO2)培养4 h，复氧(90%O2+10%CO2)2 h，制备高糖心肌细胞缺氧复氧损伤模型，DEX组和3-MA组于缺氧前1 h时加入右美托咪定，终浓度5 μmol/L，3-MA组右美托咪定孵育1 h时加入3-MA，终浓度5 μmol/L。于复氧后2 h时采用CCK-8法测定细胞活力，采用试剂盒检测上清液LDH活性，采用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3、P62和Beclin-1的表达，计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，采用RT-PCR法检测P62和Beclin-1 mRNA的表达。结果与C组比较，HG+H/R组、DEX组和3-MA组细胞活力降低，HG+H/R组和3-MA组上清液LDH活性升高，细胞P62表达下调，3-MA组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低，HG+H/R组Beclin-1表达下调(P<0.05)；与HG+H/R组比较，DEX组上清液LDH活性降低，Beclin-1和P62及其mRNA表达上调，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，3-MA组上清液LDH活性升高(P<0.05)；与DEX组比较，3-MA组细胞活力降低，上清液LDH活性升高，细胞Beclin-1和P62及其mRNA表达下调，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05)。结论自噬参与了右美托咪定减轻大鼠高糖离体心肌细胞缺氧复氧损伤的过程。

简介：摘要目的评价TANK结合激酶1(TBK1)过表达对小鼠高糖离体心肌细胞缺氧复氧损伤的影响及其与线粒体自噬的关系。方法正常培养的对数期小鼠HL-1心肌细胞，以1×106个/ml的密度接种于6孔板，采用随机数字表法分为4组(n＝10)：对照组(C组)、高糖组(HG组)、高糖缺氧复氧组(HG+H/R组)和TBK1过表达组(TBK1组)。细胞密度达到50%时使用含1%胎牛血清+1%双抗培养基孵育细胞24 h，细胞密度达到80%时，以pcDNA3.1(+)为载体进行TBK1过表达。采用高糖培养基(33 mmol/L)培养24 h，37 ℃培养箱缺氧(94%N2+5%CO2+1%O2)24 h，37 ℃含5%CO2培养箱复氧12 h，制备高糖心肌细胞缺氧复氧损伤模型。细胞复氧后采用CCK-8法检测细胞活力，采用LDH试剂盒检测上清液LDH活性，采用Mito-Tracter绿色荧光探针检测线粒体含量，采用Western blot法检测TBK1及线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3B和P62的表达。结果与C组比较，HG组和HG+H/R组小鼠心肌细胞活力降低，上清液LDH活性增加，线粒体含量减少，TBK1、PINK1、Parkin和LC3B表达下调，P62表达上调(P<0.05)；与HG组比较，HG+H/R组小鼠心肌细胞活力降低，上清液LDH活性增加，线粒体含量减少，TBK1、PINK1、Parkin和LC3B表达下调，P62表达上调(P<0.05)；与HG+H/R组比较，TBK1组小鼠心肌细胞活力升高，上清液LDH活性减少，线粒体含量增加，TBK1、PINK1、Parkin和LC3B表达上调，P62表达下调(P<0.05)。结论TBK1过表达减轻小鼠高糖离体心肌细胞缺氧复氧损伤的机制与其恢复线粒体自噬有关。