简介:研究了5-AZA、AngII及其联合诱导人心脏干细胞向心肌细胞分化和提高分化率的方法。经患者或家属同意,从心外科手术中获取人心脏右心耳组织,Ⅱ型胶原酶消化、培养、传代,选用P2-P8细胞与心脏干细胞抗体CD117(c-kit)结合后,经流式细胞仪无菌分选纯化心脏干细胞,对分选纯化后的c-kit+CSCs进行培养(见前期试验)。选取无菌分选纯化后c-kit+CSCs进行诱导、分化实验。实验随机分为四组:对照组(普通心脏干细胞培养液)、5-AZA诱导组、AngII诱导组、5-AZA和AngII联合诱导组。4周后用WesternBlotting测定心肌细胞特异性蛋白cTnI、Cx43的表达;用流式细胞仪测定各组心肌细胞分化率。人心脏干细胞诱导4周后,Westernblotting结果显示,四组均有cTnI、Cx43表达,对照组表达最弱,5-AZA和AngII联合组表达最强。人心脏干细胞诱导4周后流式细胞仪测定各组心肌细胞分化率,统计结果显示:对照组(27.86±4.52)%、5-AZA组(52.71±7.40)%、AngII组(40.48±7.02)%、5-AZA和AngII联合组(64.74±6.11)%;四组间均有统计学差异(P〈0.05)。5-AZA、AngII均能诱导人c-kit+CSCs分化为心肌细胞,5-AZA和AngII联合诱导的心肌细胞分化率高于5-AZA、AngII单独诱导方案。
简介:摘要目的评价不同密度低温缺氧复氧大鼠心脏成纤维细胞(RCF)对心肌细胞损伤和细胞间偶联的影响。方法体外培养RCF,采用随机数字表方法分为3组(n=12):密度0.5×105个/ml组(T0.5组)、密度为1.0×105个/ml组(T1.0组)和密度为2.0×105个/ml组(T2.0组)。3组置于缺氧装置中,以5 L/min的速度持续吹入95%N2+5%CO2 15 min进行缺氧处理,然后置入4 ℃冰箱培养1 h进行低温处理;培养完成后,置于37 ℃、含95%空气+5%CO2培养箱中复氧4 h。上述处理结束后,3组分别与相同密度(1.0×105个/ml)的心肌细胞采用Transwell小室间接共培养16 h,心肌细胞接种于Transwell小室下层,RCF接种于Transwell小室上层。共培养结束后,收集心肌细胞,采用CCK8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR法检测缝隙连接蛋白43(Cx43) mRNA的表达,Western blot法检测Cx43及磷酸化Cx43(p-Cx43)的表达。结果与T0.5组相比,T1.0组和T2.0组心肌细胞活力、细胞凋亡率、Cx43、p-Cx43及Cx43 mRNA表达水平降低(P<0.01);与T1.0组相比,T2.0组心肌细胞活力、细胞凋亡率、Cx43和p-Cx43表达水平降低(P<0.01),心肌细胞Cx43 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论低温缺氧复氧RCF在一定范围内呈密度依赖性地诱导心肌细胞损伤,其机制可能与下调Cx43的表达,降低Cx43的活性有关。
简介:目的探讨一种可溶性的外分泌因子midkine-a在斑马鱼胚胎心脏发育过程中的功能.方法在整体胚胎上做midkine-aRNA的原位杂交实验;利用原有的转基因斑马鱼系Tg(pmidkine-a:EGFP),动态观察胚胎从出生到心脏发育成形这一段时间心脏荧光表达情况;将原有的转基因斑马鱼体系Tg(phsp:midkine-a:EGFP)胚胎进行热休克而过表达midkine-a,观察胚胎心脏表型;利用Tg(pcmlc2:dsRed)鱼系胚胎的心肌细胞核带有红色荧光,能进行单个心脏心肌细胞计数这一特点,将杂合的Tg(phsp:midkine-a:EGFP)鱼系与纯合的Tg(pcmlc2:dsRed)鱼系交配,以得到Tg(phsp:midkine-a:EGFP/pcmlc2:dsRed)的杂合胚胎,对其进行热休克而过表达midkine-a,计算每个胚胎心脏内心肌细胞的总数;用吗啉寡聚核苷酸(morphonino,MO)阻碍新生胚胎内的midkine-amRNA表达,观察胚胎心脏表型.结果原位杂交试验证实midkine-a在胚胎48hpf(hourpostfertilization,受精后,用来标记斑马鱼胚胎年龄)大时表达于心脏;转基因Tg(pmidkine-a:EGFP)胚胎在72hpf时其EGFP表达于心脏;Tg(phsp:midkine-a:EGFP)胚胎在过表达midkine-a后心脏变小;吗啉寡聚核苷酸敲除midkine-a对胚胎心脏发育无影响;最后在Tg(phsp:midkine-a:EGFP/pcmlc2:dsRed)鱼系胚胎内过表达midkine-a导致其单个心脏内心肌细胞数目变少,与其小心脏外形吻合.结论midkine-a在斑马鱼胚胎发育过程中表达于胚胎心脏;过表达midkine-a导致胚胎心脏内心肌细胞总数减少及心脏变小;敲除midkine-a则对胚胎心脏发育无影响.
简介:摘要目的比较脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)对多能干细胞诱导的人源心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPS-CMs)及原代新生大鼠心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的影响。方法不同浓度LPS处理hiPS-CMs和原代新生大鼠CMs 24 ~ 48 h,通过实时无标记细胞分析技术(xCELLigence Real-Time Cell Analyser Cardio system RTCA) 观察hiPS-CMs和原代新生大鼠CMs的电生理变化;qRT-PCR方法检测NPPB mRNA表达水平和qPCR阵列法检测炎性基因表达水平。结果不同浓度LPS刺激后,原代新生大鼠CMs的电生理变化为搏动频率增加和搏动幅度减少(P<0.01),NPPB mRNA表达水平增加(P<0.01)。在hiPS-CMs中,相对应的LPS浓度刺激未能引起搏动幅度和搏动频率显著变化(P>0.05),NPPB mRNA表达水平未显著增加(P>0.05)。进一步增加浓度(2.5 μg/mL~40 μg/mL),hiPS-CMs的搏动幅度和搏动频率仍未发生明显变化(P>0.05),NPPB mRNA在高浓度LPS(5 μg/mL~40 μg/mL)发生差异性改变(P<0.01)。最后,在炎症相关基因表达方面,原代新生大鼠CMs表现为C3、Gpnmb、Atf3、Il6r和Ly96基因水平上调至1.5倍,hiPS-CMs表现为AK4、TOLLIP、SPP1、FABP1、IL6R、LY96和C3基因水平上调至1.5倍。结论与原代新生大鼠CMs相比,hiPS-CMs受到LPS的损伤明显减轻,表现出不同的炎症基因表达模式。
简介:摘要目的探讨肌细胞增强因子(MEF)-2的基因多态性(SNP)与先天性心脏病(CHD)发生间的联系。方法收集广西医科大学第一附属医院心胸外科2020年4月至2020年9月50例无血缘关系的广西壮族CHD儿童患者的临床资料以及血液标本,同时随机选取50例无血缘关系的健康儿童做对照,提取外周血DNA,实验采用聚合酶链反应(PCR)-DNA检测技术,对50例对照组儿童与50例CHD患儿的基因MEF-2开展全部编码外显子,借助PCR技术进行相应片段的扩增,对扩增所得片段经由直接测序法完成测序,并对结果展开分析。应用SPSS 20.0统计软件分析,采用χ2检验检测等位基因与各基因型于2组研究对象间的频率分布,以P<0.05为差异有统计意义。结果在对MEF-2A基因突变的筛查中,未见明显突变。在1例患儿中的MEF-2A因子第3外显子区域内发现一个SNP位点,位于241位氨基酸(半胱氨酸)密码子的第三位碱基C-T,即c.241C>T,属于同义突变。2组之间未见显著不同表现(基因型频率对比χ2=0.659,P>0.05;等位基因频率对比χ2=0.022,P>0.05),差异无统计学意义。在观察组和对照组之间SNP位点,CHD组的T等位基因携带率(T=84%)明显高于对照组(T=65%),比值比(OR)为0.354。结论MEF-2A基因SNP位点的T等位基因可能是影响广西壮族儿童CHD产生的危险因素。
简介:目的观察心脏跳动中二尖瓣置换术患者心房肌细胞热休克蛋白70(HSP70)的表达情况。方法将同期30例行二尖瓣置换术的风湿性心脏病患者随机分为两组,试验组(浅低温心脏跳动中施术组,16例)与对照组(传统中低温心脏停跳中施术组,14例)。分别于体外循环(CPB)前。拔除上腔静脉插管时留取右心房组织标本,采用Westernblot法测定心房肌细胞HSP70的表达情况。结果对照组CPB前与CPB后心房肌细胞HS%的表达分别为(160.23±7.12)μg/ml、(165.25±6.29)μg/ml;试验组CPB前与CPB后分别为(163.59±6.35)μg/ml、(196.34±4.23)μg/ml。与CPB前比较,试验组CPB后心房肌细胞HSP70的表达明显升高(P〈0.01);而对照组CPB前后,心房肌细胞HSP70虽有所表达,但差异无统计学意义(P〉0.05);两组CPB后心房肌细胞HSP70的表达,试验组要比对照组高(P〈0.05)。结论在心脏跳动中施术能较好地诱发HSP70高表达从而具有较好的心肌保护效果,此术式对心肌细胞的缺血-再灌注损伤要比传统手术小。
简介:目的:探讨新生大鼠心肌细胞的分离和培养方法。方法:应用0.0625%的胰蛋白酶重复消化出生第2d乳鼠的心肌组织多次,收集的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基中和,用差速贴壁分离法分离.在以溴脱氧尿嘧啶(Brdu)纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育7d。结果:分离1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为140万个,且有活力心肌细胞占90%以上;培养4~6h的乳鼠心肌细胞开始贴壁生长,12~24h明显增殖,3~4d后细胞融合成片;心肌细胞由圆形变为梭形、星形、多角形。并出现自发性节律性搏动。结论:本研究应用的心肌细胞原代培养方法可获得高产量、高活力的心肌细胞,是一种可靠的心肌细胞培养方法。
简介:摘要目的探讨骨骼肌细胞Syncytin-1过表达对脊髓前角运动神经元-骨骼肌细胞-施万细胞共培养模型炎性因子、钠离子依赖性中性氨基酸转运体1(ASCT1)和神经保护因子的影响。方法(1)体外原代培养脊髓前角运动神经元、骨骼肌细胞、施万细胞,免疫荧光染色分别检测细胞胆碱乙酰转移酶(ChAT)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙结合蛋白B(S100B)的表达进行鉴定。(2)将Syncytin-1重组质粒及空载质粒分别转染骨骼肌细胞后24 h,与另外2种细胞混合,分别建立3种细胞的共培养模型(Syncytin-1重组质粒转染组:Syncytin-1重组质粒转染的骨骼肌细胞、脊髓前角运动神经元、施万细胞混合;空载质粒转染组:空载质粒转染的骨骼肌细胞、脊髓前角运动神经元、施万细胞混合)。于倒置显微镜下观察共培养细胞形态及连接的变化。共培养48 h后应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测2组共培养细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、血管内皮生长因子(VEGF)的浓度,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting分别检测2组共培养细胞Syncytin-1、ASCT1、TNF-α、iNOS、VEGF mRNA和蛋白的表达。结果(1)免疫荧光染色检测显示:脊髓前角运动神经元中ChAT阳性表达细胞、骨骼肌细胞中α-SMA阳性表达细胞、施万细胞中S100B阳性表达细胞均占95%以上,且定位在细胞质内。(2)Syncytin-1重组质粒转染组及空载质粒转染组共培养细胞的数量及形态未见明显差异。与空载质粒转染组比较,Syncytin-1重组质粒转染组共培养细胞上清液TNF-α、iNOS及VEGF的浓度均增高,细胞TNF-α、iNOS、Syncytin-1、VEGF mRNA和蛋白的表达均增高,ASCT1 mRNA和蛋白的表达均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论骨骼肌细胞Syncytin-1过表达可以引起共培养细胞炎性因子释放、ASCT1表达降低、神经保护因子VEGF表达增高。