简介：摘要目的探讨慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）幼鼠胫骨生长板软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路对生长板发育的影响。方法雄性4周龄SD幼鼠40只，被随机分为对照组（蒸馏水灌胃，n=20）和CRF组（腺嘌呤150 mg·kg-1·d-1灌胃，n=20），连续灌胃6周后处死全部幼鼠，比较两组幼鼠胫骨长度。micro-CT扫描仪测量胫骨近端生长板宽度，组织切片番红固绿染色检测胫骨生长板宽度。提取幼鼠胫骨生长板软骨细胞进行体外培养至第3代，免疫组织化学染色法检测软骨细胞Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）及β联蛋白（β-catenin）的表达。Western印迹法检测软骨细胞CollagenⅡ、MMP-13、β-catenin蛋白表达水平。结果与对照组相比，CRF组幼鼠胫骨长度较短[（27.32±5.81）mm比（35.43±3.61）mm，t=5.226，P<0.001]，生长板宽度较窄[（0.72±0.22）mm比（1.13±0.27）mm，t=5.096，P<0.001]。软骨组织番红固绿染色结果显示，CRF组幼鼠生长板相对宽度较对照组窄（t=6.744，P<0.001）。免疫组化及Western印迹结果示，与对照组比较，CRF组软骨细胞CollagenⅡ蛋白表达减少（t=8.212，P<0.001），MMP-13（t=13.091，P<0.001）和β-catenin（t=7.534，P<0.001）蛋白表达增多。结论CRF幼鼠胫骨生长板软骨细胞Wnt/β-catenin通路相关蛋白呈高表达状态，是软骨细胞加速退变分化、生长板出现闭合趋势的原因之一。

简介：摘要目的探讨慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）幼鼠胫骨生长板软骨细胞线粒体自噬水平及对细胞凋亡的影响。方法雄性4周龄Sprague-Dawley（SD）幼鼠40只，按照随机数字表法分为正常对照组（蒸馏水灌胃）和CRF组（腺嘌呤150 mg·kg-1·d-1灌胃），连续灌胃6周后处死幼鼠，X线测量胫骨长度，组织学切片测量比较胫骨生长板宽度，应用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测生长板软骨细胞凋亡率；体外培养正常对照组和CRF组幼鼠胫骨生长板软骨细胞至第3代，应用TUNEL技术检测软骨细胞凋亡率，应用荧光双染技术观测软骨细胞线粒体与自噬溶酶体共定位情况，应用Western印迹法检测线粒体标志蛋白线粒体外膜转位酶（translocase of the outer mitochondrial membrane-20，Tom-20）和自噬标志轻链蛋白-3（light chain-3，LC-3）表达情况，应用透射电镜观察软骨细胞线粒体自噬情况。结果与正常对照组相比，CRF组幼鼠胫骨长度较短[（27.32±5.81）mm比（35.43±3.61）mm，t=5.226，P<0.001]，生长板相对宽度较窄（0.56±0.19比1.00±0.21，t=6.744，P<0.001），软骨细胞凋亡率较高（17.2%±4.8%比5.1%±3.4%，t=6.505，P<0.001）。CRF组体外培养生长板软骨细胞凋亡率高于正常对照组（11.8%±6.2%比3.1%±1.2%，t=4.357，P<0.001），荧光双染技术结果显示CRF组软骨细胞线粒体与自噬溶酶体出现明显的共定位现象，CRF组软骨细胞LC-3蛋白（t=8.944，P<0.001）及Tom-20蛋白（t=6.708，P<0.001）表达均少于正常对照组，电镜结果显示CRF组软骨细胞内出现较多的自噬囊泡吞噬线粒体并降解的现象。结论CRF幼鼠胫骨生长板软骨细胞线粒体自噬水平出现增高现象，导致线粒体减少，引起软骨细胞凋亡、数量减少，最终导致胫骨发育不良。

简介：摘要目的探讨慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）幼鼠胫骨生长板软骨细胞初级纤毛高表达加速软骨细胞分化的机制。方法选取雄性4周龄SD大鼠40只，体重（98±3）g，随机分为对照组（蒸馏水，n=20）和CRF组（腺嘌呤150 mg·kg-1·d-1，n=20），连续灌胃6周后处死幼鼠，采用胫骨制作组织学切片比较生长板长度，免疫荧光检测软骨细胞初级纤毛表达率、Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β联蛋白（β-catenin）表达水平；体外培养两组幼鼠胫骨生长板软骨细胞至第3代，免疫荧光检测软骨细胞初级纤毛表达率及印度刺猬蛋白（Indian hedgehog，IHH）和Wnt/β-catenin通路拮抗蛋白糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）表达水平；应用免疫共沉淀检测IHH与GSK3β之间的作用关系。结果与对照组相比，CRF组组织学切片生长板相对长度变短[（0.51±0.11）比（1.00±0.08），t=16.11，P<0.001]，软骨细胞初级纤毛表达率增高[（26.3±5.5）%比（7.6±1.9）%，t=14.37，P<0.001]，软骨细胞β-catenin蛋白表达增多[（7.1±2.0）分比（3.6±1.0）分，t=7.10，P<0.001]。体外培养结果显示，与对照组相比，CRF组软骨细胞初级纤毛表达率增高[（31.4±8.2）%比（12.5±3.1）%，t=9.64，P<0.001]，IHH蛋白表达增多[（1 360±270）比（310±84），t=16.61，P<0.001]，而两组GSK3β蛋白表达差异无统计学意义[（850±195）比（780±140），t=1.30，P=0.200]。免疫共沉淀检测结果显示，CRF组GSK3β蛋白与IHH蛋白在软骨细胞内存在直接相互作用。结论CRF幼鼠胫骨生长板软骨细胞初级纤毛表达增多，相关蛋白IHH表达增多，IHH蛋白与Wnt/β-catenin信号通路拮抗蛋白GSK3β存在直接作用，导致Wnt/β-catenin信号通路激活、软骨细胞加速分化，最终导致生长板出现闭合趋势。

简介：摘要目的探讨慢性肾功能不全幼鼠脊柱椎体生长板区甲状旁腺激素相关蛋白(Parathyroid hormone-related protein，PTHrp)受体表达对椎体发育的影响。方法将60只2周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠按每组20只，平均分为假手术组、模型组和治疗组。假手术组大鼠切开暴露左侧输尿管后缝合，模型组大鼠行左侧输尿管结扎，治疗组大鼠行左侧输尿管结扎并用依那普利治疗。术后4周，3组各处死10只大鼠并检测其血PTHrp浓度。拍摄脊柱正位X线片测量腰椎1～腰椎6长度，组织学切片观测脊柱椎体生长板增殖区组成细胞柱的细胞数量，免疫组织化学检测椎体生长板区PTHrp受体表达。将每组剩余大鼠处死后提取椎体生长板区软骨细胞进行体外培养至P3代，原位杂交检测PTHrp受体mRNA表达，并应用PCR行定量分析；免疫荧光检测PTHrp受体蛋白表达，并用Western-blot行定量分析。应用EDU技术检测细胞24 h增殖率。最后应用单因素方差分析对各组间差异进行统计学分析。结果假手术组、模型组和治疗组大鼠血PTHrp浓度分别为(0.48±0.14)ng/L、(1.05±0.21)ng/L和(0.70±0.19)ng/L，另两组与假手术组比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。模型组和治疗组腰椎1～腰椎6长度分别为(44.6±11.5)mm和(46.8±13.5)mm，均较假手术组(58.1±9.6)mm短，且差异有统计学意义(P均<0.05)；模型组和治疗组椎体生长板增殖区细胞柱细胞数分别为(2.3±1.1)个和(2.1±1.4)个，均较假手术组(4.1±1.2)个减少，且差异有统计学意义(P均<0.05)。免疫组织化学结果显示，假手术组PTHrp受体高表达，定量分析评分为(7.1±1.8)分；治疗组次之，为(5.4±2.1)分，模型组表达最少，为(3.6±1.9)分，组间比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。模型组和治疗组体外培养软骨细胞内PTHrp受体mRNA相对表达量分别为0.24±0.14和0.36±0.13，均低于假手术组1.01±0.32，且差异有统计学意义(P均<0.05)。模型组和治疗组细胞24 h增殖率分别为(8.7±2.6)%和(14.3±7.1)%，均低于假手术组(21.4±7.3)%，且差异有统计学意义(P均<0.05)。结论慢性肾功能不全幼鼠血液PTHrp浓度增高，椎体生长板区软骨细胞PTHrp受体由于负反馈原因表达减少，PTHrp无法发挥促进增殖作用，最终导致椎体发育障碍。