简介：摘要目的通过沉默人永生化角质形成细胞HaCaT细胞中nicastrin（NCSTN）基因的表达，研究其下游细胞增殖及分化相关信号通路的改变。方法将HaCaT细胞分为干扰组、阴性对照组和空白对照组：干扰组转染特异性NCSTN-siRNA，阴性对照组转染阴性对照siRNA，空白对照组转染等量转染试剂。实时PCR及Western印迹检测各组NCSTN mRNA和蛋白表达验证转染效率。运用Agilent人类全基因组表达谱芯片技术研究干扰组HaCaT细胞基因表达谱与阴性对照组之间的差异，以表达上调或者下调倍数≥ 2.0且P ≤ 0.05为标准，将差异基因用GO分析进行富集，筛选出表达差异显著且与角质形成细胞增生分化相关的基因，用实时PCR验证结果。结果干扰组HaCaT细胞NCSTN mRNA及蛋白相对表达量分别为0.287 ± 0.090、0.443 ± 0.085，明显低于阴性对照组（0.969 ± 0.127、1.047 ± 0.114）以及空白对照组（1.000 ± 0.151、1.000 ± 0.111），差异均有统计学意义（F值分别为30.787、31.139，P值均为0.001）。表达谱芯片显示，与阴性对照组相比，干扰组表达下调基因605条，上调基因444条。GO分析显示，干扰后差异表达基因富集到上皮发育、上皮细胞分化、角质形成细胞分化、角化4种生物学过程。对表达差异显著且与角质形成细胞增生分化相关的Sprouty相关蛋白2基因、表皮生长因子7基因、胰岛素样生长因子结合蛋白5基因、人Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶2基因和骨形成发生蛋白6基因通过实时PCR验证，验证结果与芯片结果显示的差异趋势一致。结论NCSTN基因功能缺失有可能通过调节其下游细胞增殖及分化相关信号通路的表达，影响角质形成细胞的正常增殖和分化。

简介：摘要目的检测NCSTN基因稳定沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）增殖活性及相关分化蛋白的改变，初步探索反常性痤疮发病的可能机制。方法构建慢病毒介导shRNA沉默NCSTN基因的HaCaT细胞模型（shRNA组），转染空载慢病毒的HaCaT细胞作为阴性对照组，实时定量PCR和Western印迹法检测NCSTN基因的沉默效率。CCK8法检测HaCaT细胞增殖活性，实时定量PCR和Western印迹法检测HaCaT细胞角蛋白（CK1、CK5、CK7、CK10、CK14、CK16、CK17、CK18、CK19、CK20）及其他分化分子（内披蛋白、兜甲蛋白）mRNA和蛋白的表达。两组计量资料的比较采用两独立样本t检验。结果shRNA组NCSTN mRNA及蛋白表达（0.42 ± 0.19、0.30 ± 0.07）均显著低于阴性对照组（1.00 ± 0.34、1.00 ± 0.26；t = 5.196、2.637，P < 0.001、< 0.05），基因沉默效率达70%。与阴性对照组相比，shRNA组HaCaT细胞明显增殖活跃，CK16、CK19蛋白表达显著下调（t = 3.787、3.817，P < 0.01、< 0.05），终末分化分子内披蛋白表达明显降低（t = 2.904，P < 0.05）。结论稳定沉默NCSTN基因表达会引起HaCaT细胞异常增殖分化，为后续探究NCSTN基因突变引起反常性痤疮提供新思路。

简介：摘要目的探讨K-ras基因对PM2.5染毒人支气管上皮（HBE）细胞部分癌基因和抑癌基因表达的影响。方法于2019年9月，根据K-ras基因mRNA序列，设计合成干扰序列，转染HBE细胞构建K-ras基因沉默细胞。用10、50 μg/ml PM2.5混悬液及10 μmol/L Cr6+分别染毒HBE细胞和K-ras基因沉默细胞，实时荧光定量PCR检测c-myc、c-fos、N-ras、cyclin-D1、p16、p53基因的mRNA表达水平，Western blot检测c-myc和p53蛋白表达水平。结果K-ras基因沉默细胞中K-ras基因mRNA表达水平下降（80.5%±3.6%），K-ras蛋白表达水平下降（58.9%±4.7%）（P<0.01）。各浓度PM2.5染毒HBE细胞组、K-ras沉默细胞组及10 μmol/L Cr6+染毒HBE细胞组、K-ras沉默细胞组c-myc、c-fos、N-ras、cyclin-D1基因mRNA表达水平均高于未染毒相应细胞对照组，p16和p53基因mRNA表达水平低于未染毒相应细胞对照组（P<0.01）；10 μg/ml PM2.5染毒K-ras沉默细胞组c-myc、c-fos、p16基因mRNA表达水平低于10 μg/ml PM2.5染毒HBE细胞组，p53基因mRNA表达水平高于10 μg/ml PM2.5染毒HBE细胞组（P<0.01）；50 μg/ml PM2.5染毒K-ras沉默细胞组c-fos、N-ras、cyclin-D1、p16和p53基因mRNA表达水平均低于50 μg/ml PM2.5染毒HBE细胞组（P<0.01）。50 μg/ml PM2.5染毒HBE细胞组c-myc蛋白表达水平高于未染毒HBE细胞组，p53蛋白表达水平低于未染毒HBE细胞组（P<0.05）；50 μg/ml PM2.5染毒K-ras沉默细胞组c-myc蛋白表达水平高于未染毒K-ras沉默细胞组（P<0.05）。结论PM2.5可引起HBE细胞癌基因表达升高，K-ras基因沉默能抑制PM2.5诱导HBE细胞癌基因的表达。

简介：摘要目的探讨PAX2基因沉默对梗阻性肾病大鼠肾功能的影响。方法64只幼年雄性大鼠随机分为阴性对照组(NC)和沉默组(RNAi)各32只，均于转染后按照3、5、7、14 d分为4组，每组8只，留取血、尿和肾组织标本，实时定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative PCR，Real-time PCR)检测肾组织PAX2 mRNA的沉默效果，全自动生化分析仪检测血肌酐与尿β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)的含量。结果与对照组相比，3、5、7、14 d沉默组的PAX2 mRNA表达量均明显降低，差异具有统计学意义[(1.61±0.19)比(1.13±0.23)，(1.81±0.37)比(1.22±0.34)，(3.12±0.29)比(1.81±0.24)，(4.12±0.46)比(2.07±0.33)，t值分别是3.33、2.82、9.74、9.65，P值均<0.05]，；对照组和沉默组各时间点(1、2、3、5、7、14 d)血肌酐水平有所波动，但差异无统计学意义[μmol /L：(43.03±8.55)比(45.65±9.43)，(45.76±4.11)比(44.87±7.27)，(45.40±8.73)比(47.53±5.72)，(47.85±8.00)比(44.93±5.85)，(47.45±7.13)比(50.47±6.78)，(50.75±6.20)比(51.29±5.91)，t值分别是0.58、0.30、0.58、0.83、0.89、0.18，P值均>0.05]；两组尿β2-MG含量在1、2、3、5、7 d差异无统计学意义[ng/mL：(1.50±0.17)比(1.38±0.23)，(1.53±0.20)比(1.40±0.26)，(1.41±0.19)比(1.50±0.13)，(1.90±0.48)比(2.17±0.59)，(3.66±0.77)比(3.17± 0.96)，t值分别是1.19、1.12、1.11、1.00、1.27，P值均>0.05]，而第14 d对照组明显高于沉默组[ng/mL：(6.08±1.01)比(4.16±1.05)，t＝3.73，P<0.05)]。结论PAX2基因沉默在梗阻晚期可以降低单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠尿中β2-MG含量，改善肾功能。

简介：摘要目的研究p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因沉默对大气细颗粒物（PM2.5）染毒肝细胞（L02细胞）相关基因表达的影响。方法于2019年6至9月，根据GenBank提供的p38MAPK基因序列，设计合成3条干扰序列，退火后连接到PLVX-shRNA2-puro中，将重组慢病毒载体转染L02细胞。用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白免疫印迹（Western blotting）法对p38MAPK基因沉默效果进行鉴定。用浓度为50 μg/ml的PM2.5水溶物和10 μmol/L阳性对照Cr6+分别染毒L02细胞、p38MAPK基因沉默细胞24 h，同时设立空白对照组。用荧光定量PCR检测癌基因（c-fos、c-myc、k-ras）、抑癌基因（p53）和凋亡基因（Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9）的相对表达水平。结果p38MAPK基因沉默细胞中p38MAPK基因和蛋白表达水平较正常L02细胞明显下降（P<0.05），p38MAPK基因沉默细胞株构建成功。与空白对照组比较，PM2.5染毒L02细胞组癌基因c-fos、c-myc、k-ras和凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达水平升高，抑癌基因p53表达水平下降，差异均有统计学意义（P<0.05）；与PM2.5染毒L02细胞组比较，PM2.5染毒p38MAPK基因沉默细胞组癌基因c-fos、c-myc、k-ras和凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达水平下降，抑癌基因p53表达水平升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论PM2.5对L02细胞癌基因、抑癌基因和凋亡基因表达有明显影响，而p38MAPK基因沉默可抑制PM2.5对L02细胞的影响。

简介：摘要目的构建人干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)沉默子的荧光素酶报告质粒，在人胚肾细胞(HEK293T)和人类宫颈癌细胞(HeLa)中检测荧光素酶活性，生物信息学预测其可能结合的转录因子并通过实验验证。方法通过PCR扩增人STING-5-1a(-124～+267，相对于转录起始位点，TSS: 0)和STING-5-2a(-124～+168)区域，亚克隆至pGL3-Basic质粒；将人STING沉默子区域STING-5-1b(+169～+267)正向反向亚克隆至pGL3-Control质粒(pGL3-C-5-1b-positive/negative)，并把STING-5-1b分为两段互补片段，亚克隆至pGL3-Control载体上，命名为pGL3-C-STING-5-1b-α(+169～+209)/pGL3-C-STING-5-1b-β(+210～+267)，双荧光素酶报告活性分析检测上述重组质粒在HEK293T和HeLa中的活性。应用生物信息学方法预测人STING沉默子的转录因子结合位点，将预测结合位点进行多点突变，检测荧光素酶活性。敲低转录因子，免疫印迹试验检测STING的表达水平。染色体免疫共沉淀反应进一步验证转录因子与人STING沉默子的结合。结果核酸测序证实，上述重组质粒构建成功。截短STING-5-1b(+169～+267)片段后相对荧光素酶活性上升。同时，与pGL3-Control质粒相比，pGL3-C-5-1b-positive重组质粒的相对荧光素酶活性下降(P<0.05)，其中，STING-5-1b-β(+210～+267)序列起主要抑制作用。应用生物信息学软件预测发现转录因子PR结构域锌指蛋白4(PRDM4)、Thanatos相关蛋白1(THAP1)、TEA域转录因子1(TEAD1)、核受体亚家族4 A组成员1(NR4A1)、类Krueppel因子4(KLF4)和叉头转录蛋白O3(FOXO3)可能与人STING沉默子区域(+210～+267)结合。对上述转录因子的结合位点进行多点突变构建突变体并转染至HEK293T和HeLa，发现THAP1-Mut和TEAD1-Mut的相对荧光素酶活性显著上升，提示STING沉默子可能含有THAP1和TEAD1的结合位点。将转录因子THAP1和TEAD1敲低后，STING的表达水平有显著上升。染色体免疫共沉淀试验表明，转录因子TEAD1和THAP1在细胞内与人STING沉默子区域结合。结论本实验成功构建了人STING沉默子荧光素酶报告质粒，通过活性比较，推测人STING的核心沉默子区位于+210～+267区域，通过生物信息学分析及点突变实验初步确定人STING沉默子可能含有的潜在转录因子结合位点。并使用免疫印迹试验和染色体免疫共沉淀进一步证实转录因子TEAD1和THAP1与人STING沉默子的结合，为后续研究提供实验资料。

简介：摘要目的研究沉默蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)基因对胃癌细胞株MGC-803增殖和迁移的影响，并探讨其相关分子机制。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与Western blotting检测人正常胃黏膜上皮细胞GSE-1和人胃癌细胞株(AGS、SGC-7901、MGC-803)中PRMT6 mRNA与蛋白的表达水平。胃癌细胞株MGC-803分为沉默对照组(NC)、PRMT6沉默组(si-PRMT6)、过表达核转录因子-κB(NF-κB/p65)组(pcDNA-p65)、si-PRMT6＋pcDNA-p65组及PRMT6沉默同时过表达基质金属蛋白酶9(MMP9)组(si-PRMT6＋pcDNA-MMP9)。Western blotting检测PRMT6、NF-κB/p65和MMP9的蛋白表达水平；CCK-8实验、Transwell实验分别检测细胞增殖、迁移率。结果qRT-PCR结果显示，PRMT6 mRNA在GSE-1、AGS、SGC-7901、MGC-803细胞中的相对表达水平分别为1.041±0.114、2.141±0.132、2.716±0.231、2.825±0.300，4组间差异有统计学意义(F＝46.082，P<0.001)，与GSE-1细胞相比，PRMT6 mRNA表达水平在AGS、SGC-7901、MGC-803细胞中明显升高(均P<0.001)。Western blotting结果显示，PRMT6蛋白在GSE-1、AGS、SGC-7901、MGC-803细胞中的相对表达水平分别为1.090±0.101、2.847±0.331、2.925±0.419、3.278±0.463，4组间差异有统计学意义(F＝22.683，P<0.001)，与GSE-1细胞相比，PRMT6蛋白表达水平在AGS、SGC-7901、MGC-803细胞中明显升高(P＝0.008；P＝0.002；P＝0.003)。MGC-803细胞沉默PRMT6 48 h后，NC组和si-PRMT6组中的PRMT6 mRNA表达水平分别为0.921±0.110、0.303±0.045；PRMT6蛋白表达水平为分别为1.032±0.105、0.289±0.043；细胞增殖活性分别为0.917±0.089、0.660±0.069；细胞迁移率为(89.122±5.109)%、(30.831±4.463)%；p-p65/p65的蛋白相对表达量比值分别为0.947±0.143、0.285±0.023；si-PRMT6组PRMT6 mRNA表达水平、PRMT6蛋白表达水平、细胞增殖活性、细胞迁移率、p-p65/p65的蛋白相对表达量比值均显著低于NC组(t＝9.006，P<0.001；t＝11.338，P<0.001；t＝3.954，P＝0.017；t＝14.881，P<0.001；t＝7.919，P<0.001)。Western blotting结果显示，NC组、si-PRMT6组、pcDNA-p65组与si-PRMT6＋pcDNA-p65组中MMP9的蛋白相对表达量为1.202±0.138、0.318±0.018、2.849±0.217与1.595±0.194，4组间差异有统计学意义(F＝127.410，P<0.001)，进一步两两比较，si-PRMT6组MMP9的蛋白相对表达量显著低于NC组(P<0.001)，而si-PRMT6＋pcDNA-p65组MMP9的蛋白相对表达量显著低于pcDNA-p65组(P＝0.002)。MGC-803细胞转染si-PRMT6同时转染pcDNA-p65或pcDNA-MMP9 48 h后，NC组、si-PRMT6组、si-PRMT6＋pcDNA-p65及si-PRMT6＋pcDNA-MMP9组细胞增殖活性分别为0.923±0.054、0.608±0.024、0.818±0.035与0.807±0.029，4组间差异有统计学意义(F＝37.343，P<0.001)，进一步两两比较，si-PRMT6＋pcDNA-p65组与si-PRMT6＋pcDNA-MMP9组细胞增殖活性显著高于si-PRMT6组(均P<0.001)；4组的细胞迁移率分别为(85.195±3.176)%、(28.419±1.845)%、(60.490±7.231)%与(53.653±6.761)%，4组间差异有统计学意义(F＝59.672，P<0.001)；进一步两两比较，si-PRMT6＋pcDNA-p65组与si-PRMT6＋pcDNA-MMP9组细胞迁移率显著高于si-PRMT6组(P＝0.002；P＝0.003)。结论PRMT6沉默可抑制NF-κB/MMP9信号通路的活化，进而抑制胃癌细胞MGC-803的增殖和迁移。

简介：无

简介：摘要目的探讨nicastrin（nct）基因对斑马鱼黑素细胞生物学功能的影响。方法利用吗啉代寡核苷酸（MO）技术针对斑马鱼nct基因mRNA设计nct-MO序列，同时设计对照MO序列（ctrl-MO），并构建5′端为MO靶序列的增强绿色荧光蛋白（EGFP）mRNA，通过显微注射的方式将nct-MO或ctrl-MO与EGFP mRNA共注射入斑马鱼胚胎中，验证nct-MO的沉默效率，观察其表型变化。以野生型斑马鱼作为空白对照组，实时荧光定量PCR检测黑素合成notch信号通路相关基因mitfa、tyr、tyrp1a、tyrp1b、dct、pmela、notch1a、notch1b、hey1 mRNA表达水平的变化。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。结果斑马鱼受精后8 h，ctrl-MO+EGFP mRNA组斑马鱼胚胎中均有绿色荧光表达，而nct-MO+EGFP mRNA组及空白对照组胚胎均未见绿色荧光。受精后48 h，nct-MO组幼鱼尾部色素沉着区面积占比（0.169 ± 0.083）低于ctrl-MO组（0.258 ± 0.042，t=3.202，P=0.005），且nct-MO组色素分布紊乱。实时荧光定量PCR显示，nct-MO组、ctrl-MO组、空白对照组间pmela、tyrp1a、hey1基因mRNA相对表达量差异有统计学意义（均P < 0.05），mitfa、tyr、tyrp1b、dct、notch1a、notch1b mRNA相对表达差异无统计学意义（均P > 0.05）；nct-MO组pmela、tyrp1a相对表达水平（0.708 ± 0.028、0.558 ± 0.136）低于ctrl-MO组（1.023 ± 0.142、1.016 ± 0.134，均P < 0.05）。结论nct基因可能通过调控斑马鱼黑素合成影响黑素细胞生物学功能。

简介：摘要目的研究成纤维细胞生长因子4(FGF4)下调对人肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响及其机制。方法采用免疫荧光技术检测A549细胞中FGF4蛋白的表达，设计并合成干扰FGF4表达的小干扰RNA(siFGF4)，转染人肺癌A549细胞，将细胞分为3组：空白对照组、阴性对照组和siFGF4组，收集各组转染48 h细胞，CCK-8法检测细胞的增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率，Hoechst 33258染色观查细胞凋亡，蛋白质印迹法检测Bcl-2和Bax的表达。结果CCK-8结果显示，siFGF4组细胞增殖能力明显受到抑制(51.10%±3.51%)，与空白对照组(99.05%±3.11%)和siNC组(99.00%±3.59%)比较，差异有统计学意义(F＝46.73，P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示，siFGF4组细胞凋亡率为59.99%±5.52%，高于空白对照组(2.98%±2.24%)及siNC组(4.76%±2.05%)，差异有统计学意义(F＝67.54，P<0.01)。蛋白质印迹法结果显示，与空白对照组及siNC组相比，siFGF4组Bcl-2的蛋白表达水平明显降低(F＝51.53，P<0.01)，Bax的蛋白表达水平明显升高(F＝41.33，P<0.05)。结论下调人肺癌A549细胞FGF4基因表达有望为肺癌基因靶向治疗提供新的靶位。

简介：摘要目的探讨沉默人PC4和SFRS1互动蛋白1(PSIP1)基因在口腔鳞状细胞癌细胞中的表达以及沉默PSIP1对口腔鳞状细胞癌细胞迁移及侵袭能力的影响，并初步探究其机制。方法采用RNA干扰技术沉默口腔鳞状细胞癌HN30细胞中PSIP1的表达，将细胞分为si-NC组(转染siRNA-NC)和si-PSIP1组(转染siRNA-PSIP1)。采用荧光实时定量PCR检测PSIP1的表达水平；细胞划痕实验和Transwell小室侵袭实验分别检测细胞迁移及侵袭能力；蛋白质印迹法检测两组HN30细胞内上皮间质转化(EMT)相关蛋白的表达情况。结果PSIP1在si-NC组、si-PSIP1组HN30细胞中的相对表达量分别为1.00±0.00、0.21±0.06，差异具有统计学意义(t＝22.30，P＝0.002)。si-NC组、si-PSIP1组HN30细胞12 h的划痕愈合率分别为(48.21±4.66)%、(42.05±11.74)%，差异无统计学意义(t＝1.46，P＝0.173)；24 h的划痕愈合率分别为(86.61±6.06)%、(67.76±3.62)%，差异具有统计学意义(t＝8.01，P<0.001)；两组细胞穿膜数目分别为(91.00±7.05)个、(23.34±4.98)个，差异具有统计学意义(t＝19.20，P<0.001)；与si-NC组相比，si-PSIP1组HN30细胞的迁移能力及侵袭能力均显著下降(均P<0.001)。si-NC组、si-PSIP1组HN30细胞中上皮钙黏素的相对表达量分别为1.06±0.02、1.43±0.13，差异具有统计学意义(t＝-4.94，P＝0.036)；神经钙黏素的相对表达量分别为1.00±0.04、0.57±0.14，差异具有统计学意义(t＝5.03，P＝0.007)；与si-NC组相比，si-PSIP1组HN30细胞的上皮钙黏素蛋白表达上调，神经钙黏素蛋白表达下调。结论沉默PSIP1可显著抑制HN30细胞的迁移及侵袭能力，其作用机制可能与PSIP1对口腔鳞状细胞癌EMT途径的影响有关。

简介：摘要目的观察小干扰RNA(siRNA)沉默精子相关抗原9(SPAG9)基因对肾癌细胞生物学功能的影响。方法体外培养人肾癌细胞786-O和OS-RC-2(购自中国科学院上海细胞库)；应用siRNA转染下调SPAG9在786-O和OS-RC-2的表达；分组采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)分析转染后SPAG9在786-O和OS-RC-2中mRNA及蛋白的表达水平；细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测转染24、48、72、96 h后786-O及OS-RC-2的增殖活性；Transwell法检测转染后786-O、OS-RC-2的迁移与侵袭能力；Western blot分析转染后786-O、OS-RC-2中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)的蛋白表达量；利用小管形成实验观察SPAG9基因沉默后，786-O血管形成能力的变化。采用t检验。结果(1)RT-PCR及Western蛋白印迹结果提示siRNA能够有效沉默786-O及OS-RC-2中SPAG9 mRNA和蛋白的表达。si-Ctrl组表达量为参照和786-Osi-SPAG9组、OS-RC-2si-SPAG9组mRNA及蛋白的表达量为(0.41±0.02、0.12±0.03，t＝14.420，P<0.01)、(0.64±0.02、0.13±0.01，t＝36.690，P<0.01)；(1.36±0.13、0.83±0.04，t＝6.816，P<0.05)、(0.93±0.01、0.63±0.04，t＝12.410，P<0.05)。(2)SPAG9基因沉默后对786-O以及OS-RC-2增殖能力无明显影响，差异无统计学意义(t＝3.182、6.674，P>0.05)。(3)SPAG9敲低后的786-O以及OS-RC-2迁移、侵袭能力显著降低，si-Ctrl组和786-Osi-SPAG9组、OS-RC-2si-SPAG9组迁移细胞数目为(105.32±10.13)、(53.34±5.17)个(t＝9.232，P<0.05)、(132.00±11.23)、(65.45±7.23)个(t＝11.161，P<0.05)；侵袭细胞数目为(88.33±16.56)、(32.08±6.79)个(t＝6.093，P<0.05)、(90.67±13.01)、(28.67±4.02)个(t＝5.924，P<0.05)。(4)SPAG9基因沉默后，786-O血管形成能力明显降低。si-Ctrl组、786-Osi-SPAG9组中平均管样结构数为12.56±2.40、3.05±0.86(t＝2.254，P<0.05)。(5)Western blot显示转染后的786-O和OS-RC-2细胞中，MMP-2的蛋白表达量显著降低。si-Ctrl组和786-Osi-SPAG9组、OS-RC-2si-SPAG9组中MMP-2的相对表达量为0.37±0.02、0.24±0.01(t＝8.712，P<0.001)、0.26±0.01、0.21±0.02(t＝4.558，P<0.05)；而TIMP-2的表达量显著升高，其相对表达量为0.52±0.03、0.59±0.03(t＝2.720，P>0.05)、0.52±0.01、0.54±0.01(t＝2.102，P>0.05)。结论SPAG9基因具有促进肾癌细胞迁移、侵袭及血管形成的能力，其机制可能与MMP-2的激活有关。

简介：摘要目的探讨沉默FAM83D对X线照射后食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞增殖、存活能力及侵袭、迁移能力的影响及机制。方法采用免疫组化法检测69例ESCC患者组织中FAM83D、E-cadherin、vimentin的表达。免疫印迹法检测ECA109、KYSE30细胞FAM83D基因沉默效果。MTS、克隆形成实验和Transwell方法检测ECA109、KYSE30细胞增殖活性、存活能力及侵袭能力。流式细胞术和免疫印迹法检测ECA109、KYSE30细胞凋亡分布、上皮-间质转化(EMT)及凋亡相关蛋白表达。结果ESCC组织中55%(38/69) FAM83D强表达，36%(25/69) E-cadherin强表达，61%(42/69) vimentin强表达；FAM83D强表达与E-cadherin强表达呈负相关(r＝-0.350，P<0.01)，与vimentin强表达呈正相关(r＝0.470，P<0.01)。ECA109、KYSE30细胞沉默FAM83D后降低了FAM83D蛋白表达(P<0.01)。MTS和克隆形成实验数据显示照射后沉默FAM83D显著抑制了ECA109、KYSE30细胞增殖水平(P<0.05)、增加了放射敏感性(P<0.01)。照射后FAM83D shRNA组ECA109、KYSE30细胞侵袭力降低(P<0.01)、E-cadherin表达增加，而N-cadherin、vimentin、Snail、p-Akt、p-GSK-3β表达降低(P<0.01)。照射后FAM83D shRNA组ECA109、KYSE30细胞凋亡率明显增加(P<0.01)，同时Bcl-2、Mcl-1表达下调，Cleaved caspase-3的表达上调(P<0.01)。结论FAM83D与ESCC的侵袭发展密切相关。沉默ECA109、KYSE30细胞FAM83D表达联合X线照射降低了其增殖、侵袭和存活能力，诱导了细胞凋亡，增加了放射敏感性，该作用可能通过Snail/Akt/GSK-3β信号途径来调控EMT。

简介：摘要目的利用超声靶向微泡破裂(UTMD)技术介导T细胞Itch基因沉默，观察T细胞免疫活性变化。方法磁珠分选纯化T细胞，构建靶向Itch基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒。实验组为超声辐照＋Itch-shRNA质粒-SonoVue微泡，对照组为超声辐照＋阴性对照shRNA质粒-SonoVue微泡，空白组未处理。转染48 h，荧光显微镜和流式细胞术评估细胞转染效率，免疫印迹(Western blot)法检测Itch基因蛋白表达水平。转染72 h,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组细胞上清液中白介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)水平。采用单因素方差分析比较多组间差异，两两比较LSD-t检验。结果利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到52.3%，转染后实验组、对照组和空白组Itch相对蛋白表达量分别为0.301±0.080、0.773±0.101和0.719±0.090，实验组Itch蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(F＝24.441，P<0.01)。转染72 h，实验组、对照组和空白组IL-2浓度分别为(417.3±37.1)ng/L、(158.7±17.3)ng/L和(147.0±10.2)ng/L，差异有统计学意义(F＝118.701，P<0.001)；IFN-γ浓度分别为(168.3±12.1)ng/L、(74.3±3.7)ng/L和(74.6±7.1)ng/L，差异有统计学意义(F＝126.833，P<0.001)；实验组IL-2和IFN-γ表达水平较对照组和空白组显著升高。结论利用UTMD技术介导Itch-shRNA转染能明显降低T细胞Itch水平，增强T细胞免疫活性。

简介：摘要目的构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型，探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列，与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒，经酶切及测序鉴定后，进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染：shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液，NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液，空白组不加病毒液。转染完成后，荧光显微镜下观察荧光表达，流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性，实时荧光定量PCR（qPCR）、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白（NCT）、早老蛋白1（PS1）、前咽缺陷蛋白1a（APH1a）mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。结果倒置荧光显微镜下观察到shRNA1~shRNA3组、NC组均有荧光表达，流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示，与NC组（1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075）相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA（0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009）、蛋白（0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062）表达均显著降低（均P < 0.001）。CCK8法显示，与NC组相比，shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高（均P < 0.05），24和60 h差异无统计学意义（均P > 0.05）；shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组（均P < 0.05）。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义（F值分别为8.168、4.644、1.981，均P > 0.05），mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义（F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663，均P ≤ 0.01）。与NC组相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低（均P < 0.01），imNCT蛋白表达变化无统计学意义（均P > 0.05）。结论成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型，PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强，γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。

简介：摘要目的探讨microRNA-145(miR-145)靶向沉默PLK1基因对肾小管上皮细胞增殖、凋亡的影响及相关机制。方法采用lipofectamine 2000试剂将miR-145转染肾小管上皮细胞，按不同转染结果分为对照组、阴性对照组及miR-145转染组，采用RT-PCR法检测肾小管上皮细胞中miR-145水平，采用CCK-8实验检测细胞增殖能力，采用流式细胞术检测细胞转染miR-145后细胞周期的分布，采用Western blot实验检测胃癌细胞Bax、Cyclin B1、PCNA及Bcl-2的表达水平，采用荧光素酶报告实验检测miR-145与PLK1基因的靶向关系。结果RT-PCR实验显示miR-145转染组肾小管上皮细胞miR-362表达水平(4.1±0.6)显著高于对照组(1.2±0.2)和阴性对照组(1.3±0.3)(P<0.05)。CCK-8实验显示肾小管细胞转染miR-145后，肾小管细胞的增殖水平低于对照组及阴性对照组(P<0.05)。采用流式细胞术显示各组肾小管细胞G0/G1期比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。miR-145转染组肾小管细胞S期比例为(14.16±2.82)%，显著低于对照组[(21.22±3.81)%]及阴性对照组[(22.56±2.69)%](P<0.05)；miR-145转染组肾小管细胞G2/M期比例为(26.37±4.51)%，显著高于对照组[(24.57±2.02)%]及阴性对照组[(22.46±2.74)%](P<0.05)。miR-145组Bax相对水平为(0.36±0.04)，显著高于对照组(0.25±0.03)及阴性对照组(0.24±0.04)(P<0.05)。miR-145组Cyclin B1、PCNA、Bcl-2相对水平分别为(0.18±0.03)、(0.27±0.03)、(0.16±0.02)，显著低于对照组[(0.28±0.02)、(0.36±0.04)、(0.32±0.03)]及阴性对照组[(0.30±0.03)、(0.40±0.03)、(0.33±0.03)](P<0.05)。通过生物信息学预测结果显示miR-145可与PLK1基因的3'-UTR结合，经荧光素酶报告基因实验进行验证，显示肾小管细胞在共转染miR-145及PLK1野生型载体后，荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05)，其他各实验组的肾小管上皮细胞的荧光素酶相对活性无明显下降(P<0.05)。RT-PCR实验显示miR-145转染组肾小管上皮细胞PLK1基因表达水平(0.31±0.13)显著低于对照组(1.03±0.15)及阴性对照组(1.04±0.17)(P<0.05)。结论miR-145可靶向抑制肾小管上皮细胞中PLK1基因表达水平，抑制细胞的增殖能力，诱发细胞发生凋亡，为肾纤维化治疗提供实验依据。

简介：摘要目的观察电转染沉默S100A11基因对胰腺癌细胞PATU8988细胞周期、增殖及侵袭能力的影响。方法通过电转染沉默PATU8988细胞株(购自北京中国科学院)S100A11基因，分为空白对照组、阴性对照组及转染组。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞S100A11基因和蛋白的表达变化；流式细胞仪检测细胞周期变化；平板克隆实验检测细胞增殖；Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力。SPSS 23.0软件行统计分析。结果S100A11基因和蛋白表达空白对照组、阴性对照组分别为(2.28±0.27，3.51±0.32)、(2.32±0.21，3.33±0.29)，转染组为(0.26±0.09，0.31±0.12)明显低于上述两组(t1＝12.290，t2＝15.620，P<0.01；t1＝16.220，t2＝16.670，P<0.01)，差异有统计学意义；细胞周期结果显示G0/G1期与S期细胞空白对照组、阴性对照组分别为(52.46±3.38，32.48±2.16)、(53.75±4.18，31.65±2.42)，转染组为(77.26±6.54，12.78±1.14)，细胞周期阻止于G0/G1期(t1＝5.830，t2＝5.470，P<0.01)，S期细胞数减少(t1＝13.970，t2＝12.220，P<0.01)，差异有统计学意义；平板克隆实验显示转染组细胞克隆形成数[(142.86±11.48)个]，明显低于空白对照组和阴性对照组[(241.34±12.52)，(239.47±16.48)个，t1＝10.040，t2＝8.330，P<0.01]，差异有统计学意义；穿膜细胞数转染组为[(95.46±19.43)个]，明显低于空白对照组和阴性对照组[(226.74±25.63)，(223.36±28.24)个，t1＝7.070，t2＝6.460，P<0.01]，差异有统计学意义。结论S100A11基因沉默显著抑制PATU8988细胞的增殖，减少S期细胞，降低细胞侵袭能力。

简介：摘要目的观察慢病毒介导的shRNA沉默肝再生磷酸酶-3(PRL-3)基因对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其对上皮间质转化(EMT)信号通路的调控。方法将携带PRL-3 shRNA的慢病毒载体转染肺癌A549细胞，建立稳定沉默PRL-3的肺癌细胞株。将细胞分为空白对照组、NC shRNA组(阴性对照组)和PRL-3 shRNA组(PRL-3抑制RNAi慢病毒组)。CCK-8法、平板克隆形成实验、Transwell和侵袭小室实验分别检测各组细胞增殖、迁移和侵袭能力。实时荧光定量PCR检测转染后上皮钙黏素(E-cadherin)、Snail mRNA的相对表达水平。结果稳定沉默PRL-3的细胞株构建成功，PRL-3 shRNA组PRL-3基因敲减效率达到83.5%。CCK-8法检测A549细胞增殖能力，空白对照组、NC shRNA组和PRL-3 shRNA组24 h吸光度(A)值分别为0.296±0.008、0.342±0.007、0.292±0.004，差异具有统计学意义(F＝106.300，P<0.001)，PRL-3 shRNA组明显低于NC shRNA组(P<0.001)；转染后48、72、96 h，PRL-3 shRNA组细胞增殖能力也明显受到抑制。克隆形成实验结果显示，空白对照组、NC shRNA组、PRL-3 shRNA组细胞集落形成数分别为(166.7±6.7)个、(158.0±6.1)个、(119.7±1.5)个(F＝67.290，P<0.001)，PRL-3 shRNA组细胞克隆形成能力较NC shRNA组显著下降(P<0.001)。空白对照组、NC shRNA组和PRL-3 shRNA组迁移细胞数分别为(100.0±1.9)个、(98.8±1.9)个和(44.6±7.6)个(F＝430.300，P<0.001)，PRL-3 shRNA组细胞迁移能力明显低于NC shRNA组(P<0.001)；3组侵袭细胞数分别为(117.7±4.1)个、(113.1±6.6)个和(55.6±8.4)个(F＝247.200，P<0.001)，PRL-3 shRNA组细胞侵袭能力明显低于NC shRNA组(P<0.001)。实时荧光定量PCR检测结果显示，沉默PRL-3表达后，A549细胞中E-cadherin mRNA相对表达水平显著上调，Snail mRNA水平显著下调。结论沉默PRL-3表达可抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力，PRL-3可能通过EMT途径影响肺癌细胞的侵袭。

简介：摘要目的探讨高压氧协同靶向水通道蛋白-4(aquaporin 4，AQP-4)的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术对改善脑创伤(trauma brain injury，TBI)大鼠认知功能的作用，并探讨其机制。方法将112只成年雄性SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、AQP-4 RNAi组、高压氧组和联合治疗组，每组28只。采用液压打击法建立大鼠TBI模型，构建靶向AQP-4的RNAi质粒；大鼠按照分组给予相应方式的干预后，于术后7 d、21 d对大鼠进行改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores，mNSS评分)；术后21～25 d进行Morris水迷宫实验，记录大鼠目标象限停留时间百分比和每日逃避潜伏期；Evans蓝法测定血脑屏障通透性，干/湿比重法检测脑组织含水量；术后7 d用Western blot法检测AQP-4、半胱天冬酶-3 (caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)蛋白表达水平；RT-PCR法检测脑组织AQP-4的mRNA表达水平；TUNEL法及Annexin V法检测脑细胞凋亡率。采用SPSS 23.0及Graphpad Prism 7.0进行数据分析，组间多样本行单因素方差分析，Morris结果采用重复测量方差分析，两两比较用LSD-t检验。结果mNSS评分结果显示，术后7 d，21 d，各组间mNSS评分差异有统计学意义(F＝4.89，7.59，均P＝0.01)，各治疗组评分均低于对照组，以联合治疗组效果最理想(7 d：t＝3.98，-7.75；21 d：t＝47.82，7.94，均P<0.05)。Morris水迷宫实验结果显示，大鼠的目标象限停留时间和逃避潜伏期的时间及组别交互作用均不显著(F＝1.83，8.42；均P>0.05)，术后第24天和第25天，联合治疗组逃避潜伏期及目标象限停留时间百分比均好于其他各组(均P<0.05)。Evans蓝染色显示，AQP-4 RNAi组、高压氧组、联合治疗组Evans蓝含量均较对照组低(均P<0.05)，联合治疗组最低(t＝6.19，P<0.05)。干湿比重法结果显示，脑组织含水量以联合治疗组[(68.15±1.52)% ]最低(P<0.05)，AQP-4 RNAi组[(76.71±1.06)% ]低于高压氧组[(80.23±1.43)%](t＝4.38，P<0.05)。Western blot结果显示，联合治疗组AQP-4、Caspase-3、MMP-2，MMP-9蛋白表达明显低于其他组(均P<0.05)，而Bcl-2表达增加(P<0.05)。RT-PCR结果(灰度值比)显示，AQP-4 RNAi组(0.61±0.21)、高压氧组(0.83±0.12)及联合治疗组(0.22±0.05)的AQP-4 mRNA水平与对照组(1.31±0.25)比，均差异有统计学意义(F＝175.05，P<0.05)，AQP-4 RNAi组优于高压氧组(t＝5.25，P<0.05)，以联合治疗组降低最明显(t＝58.94，P<0.05)。TUNEL及Annexin V法检测结果显示，各治疗组较对照组均有效抑制神经细胞凋亡，尤以联合治疗组最为明显(P<0.01)。结论靶向AQP-4 RNAi技术联合高压氧可有效促进认知功能损害的恢复，其机制可能与保护血脑屏障完整性、减轻TBI后脑水肿并抑制神经细胞凋亡有关。

简介：摘要目的探讨沉默细胞分裂周期相关基因(NUF2)对食管鳞癌细胞增殖及转移能力的影响以及其相关的分子机制。方法回顾性分析癌症基因组图谱(TCGA)数据库中食管癌患者原发病灶及其癌旁组织的NUF2基因表达差异，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法分析食管鳞癌细胞系的NUF2基因表达，设计靶向NUF2基因的沉默RNA(siRNA)序列，构建慢病毒载体，Celigo法、噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，荧光激活细胞分选法(FACS)法检测细胞凋亡，Transwell方法检测细胞迁移和侵袭能力，蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白表达，慢病毒转染过表达变化最明显的五个下游基因，再检测细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。组间比较采用t检验。结果MTT法表明，沉默NUF2基因后细胞增殖低于对照组(0.33±0.01比0.55±0.07，t＝25.90，P<0.01)，Transwell法提示沉默NUF2基因后细胞迁移低于对照组(KYSE-150：9.00±1.67比36.00±4.84，t＝35.53，P<0.01；TE-1：52±1.86比246.00±9.79，t＝45.73，P<0.01)，沉默NUF2的食管癌细胞中、过表达SNAI1基因后，增殖、迁移和侵袭能力又有所恢复。结论NUF2基因在食管鳞癌中高表达，沉默其表达能够通过下调SNAI1基因来抑制细胞增殖、迁移和侵袭。