简介:目的应用RevTet-Off系统,于体外观察四环素调节下凋亡素基因的表达及其对人肝癌细胞系HepG2的作用。方法将RevTet-Off基因调控系统的调节质粒pRevTet-Off和含凋亡素基因的重组表达质粒载体pRevTRE-VP3分别转染PT67细胞,包装出RevTet-Off和RevTRE-VP3重组逆转录病毒,依次将此两种病毒感染HepG2细胞,建立整合了RevTet-Off和RevTRE-VP3重组逆转录病毒的阳性细胞株HepG2/Off-VP3。通过四环素调节凋亡素基因在HepG2/Off-VP3中的表达,AnnexinV-FITC/PI双染色后,以流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果经RT-PCR证实凋亡素基因在HepG2/Off-VP3-8细胞得到了表达;HepG2细胞在无四环素环境下的细胞凋亡率明显高于1μg/mL四环素环境下的凋亡率。结论凋亡素基因经RevTet-Off系统导入HepG2细胞后,可在四环素调控下表达产生凋亡素并诱导细胞凋亡。
简介:目的探讨沉默甲壳质酶蛋白40(YKL-40)表达对子宫内膜癌顺铂(DDP)耐药细胞株Ishikawa/DDP的影响。方法采用DDP长期浓度梯度递增法体外建立Ishikawa/DDP耐药细胞株,并检测多药耐药相关基因(MDR1)和Bcl-2、Bax和caspase-3的表达,采用MTT法检测Ishikawa细胞和Ishikawa/DDP细胞的增殖活性,计算半数抑制浓度(IC50)。Ishikawa/DDP分别转染NC阴性序列(NC组)和siRNAYKL-40(si-YKL-40组),另设未转染细胞作为对照组,采用MTT法、划痕实验和AnnexinV/PE双染法检测DDP对si-YKL-40组Ishikawa/DDP细胞增殖、迁移能力和凋亡的影响。结果体外成功建立Ishikawa/DDP耐药细胞株,3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/LDDP对Ishikawa/DDP细胞的增殖抑制率分别为(6.93±2.45)%、(8.14±4.50)%、(11.37±4.62)%、(15.18±3.97)%、(26.29±5.08)%、(41.32±7.64)%,明显低于Ishikawa细胞(P<0.05)。DDP对Ishikawa和Ishikawa/DDP的IC50分别为14.58μmol/L和116.70μmol/L,Ishikawa/DDP的耐药指数为8.004。QPCR检测结果显示,Ishikawa细胞YKL-40、MDR1、Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA表达量分别为0.82±0.15、0.43±0.11、1.05±0.23、1.17±0.20、0.96±0.18,而Ishikawa/DDP细胞分别为1.87±0.40、2.34±0.46、1.52±0.28、0.72±0.21、0.49±0.17,差异有统计学意义(P<0.05)。3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/LDDP对si-YKL-40组细胞的增殖抑制率分别为(10.95±2.74)%、(18.73±5.30)%、(32.79±5.47)%、(52.28±6.58)%、(61.73±5.26)%、(65.45±7.33)%,明显高于对照组和NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。DDP对si-YKL-40组细胞的IC50为22.19μmol/L。与对照组和NC组比较,si-YKL-40组细胞凋亡率升高、愈合率下降;YKL-40、MDR1、Bcl-2蛋白表达量下调,Bax和caspase-3蛋白表达量上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论沉默YKL-40可显著提高Ishikawa/DDP细胞株对DDP的敏感性,并促进细胞凋亡,其具体机制可能与下调MDR1、Bcl-2表达,及上调Bax和caspase-3表达有关。
简介:目的探讨Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路对非小细胞肺癌NCI-H23细胞干性的调控作用。方法以非小细胞肺癌NCI-H23细胞为对象,以糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制剂(CHIR-99021)和β-cateninsiRNA为干预剂,分别采用噻唑蓝比色法、体外干细胞成球培养、划痕实验及免疫印迹法检测其增殖能力、体外成球能力和迁移能力方面的改变。结果CHIR-99021作用24h后NCI-H23细胞的增殖能力、干细胞成球率均明显提升,与对照组的差异均有统计学意义(P〈0.05),划痕愈合时间缩短。CHIR-999021干预后的NCI-H23细胞、NCI-H23干细胞中,GSK-3β磷酸化显著降低,增殖细胞核抗原、CD133、乙醛脱氢酶1A1、Nanog、基质金属蛋白酶-2表达增加。β-cateninsiRNA沉默β-catenin后NCI-H23中CD133、乙醛脱氢酶1A1和Nanog表达减少,干细胞成球率也较对照组降低(P〈0.05)。结论Wnt/β-catenin通路参与了非小细胞肺癌NCI-H23细胞干性调节,这对于非小细胞肺癌的防治有一定价值。
简介:目的:研究黄芪甲甙是否通过NG-Kepl/ARE信号通路发挥抗氧化作用来抑制骨髓间充质细胞的凋亡。方法:培养Witar大鼠BMSCs,设立正常组和黄芪甲甙干预组。采用实时荧光定量RT-PCR方法测定Nrf-2以及GSH的基因表达,Wetmblot检测其蛋白表达。结果:TUNEL和流式结果表明黄芪甲甙有抑制BMSC凋亡的作用,50^g/L组作用较强,与ADR组比较差异有显著性。增加浓度抑制凋亡的作用增加不明显,ADR+AST(100|JLg/L、50|JLg/L)两组,细胞凋亡率差异无显著性。黄芪甲甙作用后明显降低NmmR-NA的表达,与ADR模型组比较差异有统计学意义。各组分别与阿霉素模型组比较差异均有统计学意义。结论:黄芪甲甙可以通过Nf-2表达调控细胞凋亡,可能是其抑制神经细胞氧化应激、发挥保护作用的机制之一。
简介:目的:研究细胞周期调控因子p16、p27和CyclinD1在分化型甲状腺癌中的蛋白表达情况,及其在分化型甲状腺癌发生发展中的作用。方法:应用免疫组化S—P法对40例分化型甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌和滤泡癌以及30例甲状腺腺瘤组织中p16、p27和CyclinD1的蛋白表达情况进行检测。结果:p16、p27和cyclinD1三种蛋白在40例分化型甲状腺癌的阳性表达率分别为57.5%、70.0%和62.5%;p16蛋白的阳性表达量与分化型甲状腺癌的颈淋巴结转移之间具有相关性(P〈0.05);p27蛋白的阳性表达量与分化型甲状腺癌的颈淋巴结转移和原发灶的大小及包膜侵犯之间具有相关性(P〈0.05);CyclinD1蛋白的阳性表达量与分化型甲状腺癌的颈淋巴结转移和原发灶的包膜侵犯之间具有相关性(P〈0.05);p16的阳性表达与CyclinD1的阳性表达之间具有相关性(P〈0.05),且呈负相关关系(rs=-0.283);p27的阳性表达与CyclinD1的阳性表达之间具有相关性(P〈0.05),且呈负相关关系(rs=-0.279)。结论:p16、p27和CyclinD1三种蛋白的异常表达共同参与了分化型甲状腺癌的发生发展,可能成为判断分化型甲状腺癌恶性程度、转移及预后的指标。