简介:目的:构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法:PCR克隆人MDR1基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果:PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3-5倍。结论:成功构建含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。
简介:目的:观察粉防己碱(Tet)对人肝癌细胞株7402的放射增敏作用。方法:以人肝癌细胞株7402为研究对象,应用MTT比色法、克隆形成实验检测Tet的细胞抑制效应;应用克隆形成实验观察Tet对7402细胞株的放射敏感性的影响;流式细胞术测定照射后7402细胞株细胞周期的再分布并观察Tet能否去除放射引起的细胞周期阻滞;Westernblot检测CyclinB1、Cdc2和Cdc25C磷酸化形式的表达水平;细胞分裂指数实验观察Tet对照射后细胞分裂指数的影响。结果:不同浓度的Tet作用于人肝癌7402细胞株24h后,其细胞毒性呈剂量依赖性。Tet(0.5μg/ml)能明显降低放射后7402细胞的克隆形成率,其放射增敏比(SERDq)为1.76。流式细胞术结果显示,照射明显导致7402细胞株G2期阻滞,Tet能够去除放射引起的7402细胞G2期阻滞。Westernblot显示细胞在受到X射线照射后,CyclinB1表达水平明显降低,Cdc2和Cdc25磷酸化形式的表达水平明显增加,分裂指数也明显降低;经Tet处理后,CyclinB1表达水平明显增高,Cdc2和Cdc25磷酸化形式的表达水平明显下降,分裂指数则增高。结论:Tet对7402细胞株有放射增敏作用,其作用机制可能与Tet去除放射引起的G2/M期阻滞有关。