简介：摘要溶瘤腺病毒(OA)，也称为条件增殖型腺病毒，是经基因改造，只在肿瘤细胞中特异增殖的新一代腺病毒载体，此载体对正常细胞无影响。其能感染特定类型肿瘤细胞，通过复制、增殖、裂解并杀伤肿瘤细胞，同时利用其高效的转染效率携带治疗基因，以此提高抗肿瘤效果，利用肿瘤特异性启动子是构建OA的主要方法。本文概述了肿瘤特异性启动子在OA治疗泌尿系肿瘤中的研究进展。

简介：脑缺血的基因治疗是颇具前景的治疗手段，以病毒为载体的基因治疗的有效性和安全性关系到最终治疗的成败。重组腺相关病毒（recombinantadeno-associatedvirus，rAAV）载体作为目前安全性最好的病毒载体系统，在动物中枢神经系统（centralnervoussysterm，CNS）中已进行了有效转导。随着国内外研究的日趋深入，rAAV在脑缺血基因治疗中的应用也越来越倍受瞩目。现就其进展予以综述。

简介：目的构建人雌激素受体相关受体α(hERRα)逆转录病毒载体.方法用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pSG-hERRα质粒和pLXSN空白质粒,采用凝胶DNA回收方法回收纯化hERRα片段,用T4连接酶进行连接反应,构建成PLXSN-neo-hERRα重组体.结果经pCR、酶切鉴定、测序等对重组体进行鉴定,证实构建的重组体方向、序列正确.结论已成功构建hERRα逆转录病毒载体,为研究hERRα的功能奠定了基础.

简介：摘要将KIF5B-RET序列连接到Lenti6.3-eGFP上，重组获得慢病毒载体，包装生产慢病毒并测定其滴度，再将此慢病毒转染肺癌细胞系并筛选验证。本实验成功构建了KIF5B-RET慢病毒载体，并建立稳定表达KIF5B-RET的肺癌细胞系。

简介：摘要昆虫杆状病毒表达载体系统是基于昆虫杆状病毒及其宿主细胞建立的真核表达体系，具有安全性高、重组蛋白表达水平高、能同时表达多个基因，可对重组蛋白进行正确折叠和翻译后修饰等优势，主要应用于预防性及治疗性疫苗和基因治疗药物的研发及生产。本文对该载体系统的关键技术及应用进展作一综述。

简介：目的本研究构建含绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒，并观察其在人椎间盘髓核细胞中的表达情况。方法应用分子克隆技术将绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因导人慢病毒载体质粒pLenti6／V5TOPO，应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统（包括包装质粒、包膜蛋白质粒等）共转染入293细胞进行包装，48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，72h收集病毒上清并感染髓核细胞，在荧光显微镜下感染情况。结果重组慢病毒滴度测定约为10^7U／mL。感染人椎间盘髓核细胞后，荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了含GFP的慢病毒载体，且能成功将目的基因转入椎间盘髓核细胞并表达。

简介：目的探讨不同血清型对成熟肌纤维的转导效率.方法我们用不同的血清型AAV(rAAV-1,rAAV-2,rAAV-3和rAAV-5)表达LacZ和GDNF基因研究在小鼠骨骼肌转导效率,转基因表达用组化方法或ELISA来评定.结果在3周龄的小鼠中,LacZ组化染色显示rAAV5在慢和快的肌纤维中都有效的转导,而rAAV2和rAAV3优先在慢纤维中转导.在8周龄的小鼠(成年鼠)中,rAAV3和rAAV5在慢纤维和快纤维中都有效的转导.用rAAV3-LacZ或rAAV5-LacZ优先转导的慢纤维与rAAV2相比没有显著性差异.用8周龄的小鼠肌肉注射不同血清型的rAAV-GDNF后,结果显示rAAVl-GDNF表达最高;rAAV2、rAAV3和rAAV5在骨骼肌的表达也有效.结论在肌肉基因转导中,rAAV3和rAAV5介导的载体都是有效的,能克服rAAV2所受到的限制.

简介：摘要目的观察差异显示编码3(DD3)启动子调控的携带精子相关抗原9(SPAG9)基因短发夹RNA(shRNA)的新型溶瘤腺病毒(DD3-ZD55-SPAG9)对激素依赖性前列腺癌LNcap细胞系裸鼠移植瘤的治疗作用。方法构建裸鼠前列腺癌LNCaP细胞皮下移植瘤模型，当肿瘤体积为100 mm3随机分成3组，空白对照组(PBS组)、对照病毒组(ZD55-SPAG9组)、病毒组(DD3-ZD55-SPAG9组)。测量肿瘤体积，绘制肿瘤时间-体积生长曲线。苏木精-伊红(HE)染色观察肿瘤细胞的生长。原位缺口末端标记法(TUNEL)检测肿瘤组织内细胞凋亡。免疫组织化学检测肿瘤组织中半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3和Caspase-8蛋白的表达。采用方差分析(One way-ANOVA)，组间比较采用SNK法。结果成功构建裸鼠LNcap细胞移植瘤模型。DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组和PBS组移植瘤终体积分别为(1 104.04±110.39)、(1 003.20±150.89)和(2 321.36±173.87) mm3。DD3-ZD55-SPAG9组和ZD55-SPAG9组肿瘤体积均小于PBS组，差异有统计学意义(F＝203.997，P<0.05)，但DD3-ZD55-SPAG9组、ZD55-SPAG9组之间差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色结果显示，DD3-ZD55-SPAG9组和ZD55-SPAG9组的肿瘤组织中均可见较多的死细胞，细胞裂解成碎片，细胞核固缩碎裂，其正常的组织结构消失，两者差异无统计学意义(P>0.05)。TUNEL结果显示，DD3-ZD55-SPAG9组和ZD55-SPAG9组的肿瘤组织切片荧光下均可见较多红色信号，提示细胞凋亡，凋亡信号强度明显高于PBS组，差异有统计学意义(F＝80.932，P<0.05)，两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组织化学法检测肿瘤组织中Caspase-3和Caspase-8蛋白表达的结果显示，DD3-ZD55-SPAG9组和ZD55-SPAG9组与PBS组比较，Caspase-3和Caspase-8蛋白表达量增多，差异有统计学意义(F＝73.848、61.514，P<0.05)，两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论DD3-ZD55-SPAG9可以有效抑制前列腺癌LNCaP细胞皮下移植瘤的生长，与对照病毒ZD55-SPAG9比较差异无统计学意义，其机制包括抑制肿瘤细胞生长、诱导凋亡。

简介：摘要目的探讨腺病毒介导的shRNA下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因（PTEN）表达对活化肝星状细胞（HSC）的纽蛋白（vinculin）、细丝蛋白A（filamin A）及皮层肌动蛋白（cortactin）的影响。方法体外培养活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6，将携带靶向PTEN的RNA干扰序列[短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）]的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN及对照空病毒Ad-GFP转染HSC；采用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测各组HSC的PTEN mRNA及蛋白表达；借助激光扫描共聚焦显微镜，采用免疫荧光法检测各组HSC的vinculin、filamin A及cortactin表达变化，并利用Image-pro plus 6.0软件进行图像分析处理，计算所测蛋白荧光表达的积分光密度值（IOD）。实验分为3组：对照组（在腺病毒转染步骤以DMEM代替腺病毒液）、Ad-GFP组（转染仅表达绿色荧光蛋白的空病毒Ad-GFP）、Ad-shRNA/PTEN组（转染携带靶向PTEN的shRNA并表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN）。3组间均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验。结果靶向PTEN的shRNA成功转染并显著下调HSC的PTEN mRNA及蛋白表达（P < 0.05）；HSC的vinculin主要表达于细胞质，Ad-shRNA/PTEN组HSC的vinculin荧光IOD （19 758.83±1520.60）较对照组（7 737.16±279.93）及Ad-GFP组（7 725.50±373.03）显著升高（P < 0.05），而对照组与Ad-GFP组之间HSC的vinculin荧光IOD差异无统计学意义（P > 0.05）。3组HSC的filamin A荧光IOD差异无统计学意义（P > 0.05），但3组HSC的filamin A亚细胞分布发生了变化，Ad-shRNA/PTEN组HSC的filamin A主要分布于细胞质，而对照组和Ad-GFP组HSC的filamin A主要位于细胞核，Ad-shRNA/PTEN组HSC的filamin A核质比（0.60±0.15）明显低于对照组（1.20±0.15）及Ad-GFP组（1.08±0.23），P < 0.05；而对照组与Ad-GFP组之间HSC的filamin A核质比差异无统计学意义（P > 0.05）。3组HSC的cortactin主要分布于细胞质，Ad-shRNA/PTEN组HSC的cortactin荧光IOD（54 688.50±2 095.53）较对照组（22 959.94±1 710.42 ）及Ad-GFP组（22 547.11±1 588.72）显著升高（P < 0.05），而对照组与Ad-GFP组之间HSC的cortactin荧光IOD差异无统计学意义（P > 0.05）。结论PTEN表达下调使体外活化肝星状细胞的微丝结合蛋白vinculin及cortactin的表达上调，并使另一微丝结合蛋白filamin A的亚细胞分布发生改变即出现胞核向细胞质转位。

简介：背景:强直性脊柱炎(AS)是一种与炎症紧密相关但病因尚未完全阐明的慢性进行性结缔组织疾病。目的:本研究拟通过构建和比较AS韧带组织体外原位(insitu)、2D细胞贴壁体外(invitro)及3D水凝胶体外培养模型,旨在探索更适合模拟AS韧带体外的培养模型。方法:AS髋关节韧带组织取自我科4例重度AS拟行髋关节置换的患者,平均年龄(44.0±4.1)岁。髋关节组织块常规消化获得单细胞,并行倒置相差显微镜观察和抗vimentin免疫荧光染色(IFC)鉴定检查。对上述髋关节韧带组织与成纤维细胞分别行组织块原位、体外2D贴壁和3D海藻酸盐水凝胶法培养,重组腺病毒(rAd)5-lacZ转染上述标本14d后,分别采用大体观察、HE染色、Hoechst33258实验、X-gal染色、抗β-gal免疫组织化学染色和酶联免疫吸附实验(ELISA)等对细胞形态与增殖能力、病毒转染效率和致炎性细胞因子表达等进行检测。结果:第2代AS髋关节韧带细胞抗vimentinIFC检测均出现明显的红色荧光,结果阳性,表明分离培养的细胞为成纤维细胞。rAd5-lacZ转染上述3种模型14d后,倒置相差显微镜下观察HE染色后的细胞形态并计数单位面积下的细胞数、Hoechst33258检测细胞DNA含量和ELISA法检测细胞分泌功能提示,3种模型中以2D平面的细胞增殖效率和致炎性细胞因子分泌能力最强(F=12.21、14.91、282.67、350.18,P<0.05或0.01)、但细胞“去分化”现象亦最明显,而AS韧带组织原位培养和成纤维细胞3D海藻酸盐水凝胶培养条件下的细胞增殖效率和致炎性细胞因子表达能力相似(t=1.37、0.71、1.44、1.83,P>0.05),细胞形态前后无明显变化。抗β-gal免疫组织化学染色并计数阳性细胞数/光镜下的总细胞数得出rAd-lacZ转染3种模型效率相似,分别为65.84%、72.26%和75.39%(F=0.873,P>0.05)。结论:韧带组织原位培养和成纤维细胞3D水凝胶培养能更好地模拟AS韧带成纤维细胞体内生存环�

简介：目的探讨腺病毒介导的白介素-24（IL-24）基因转移对脂多糖（LPS）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（GMC）增生的抑制作用。方法构建携带IL-24基因的复制缺陷型腺病毒载体（Ad．IL-24）和携带绿色荧光蛋白的对照载体（Ad．GFP），在293细胞中扩增，5％FCS／DMEM中分组培养GMC，转染Ad．IL-24或Ad．GFP，加或不加LPS（10mg／L），分别用RT-PCR和ELISA检测IL-24mRNA和蛋白的表达；MTT（四甲基偶氮唑蓝法）和流式细胞术检测系膜细胞增生活性。结果培养GMC及LPS激活的GMC均未见IL-24表达。AdIL-24感染GMC后4～48hIL-24mRNA有稳定表达，培养上清IL-24含量在24和48h分别为（79．00±3．61）μg／L和（98．00±2．00）μg／L。感染AdIL-24对系膜细胞增生无影响，但可显著抑制LPS诱导的GMC增生。结论外源性IL-24基因转移可有效抑制LPS诱导的系膜细胞增生，Ad．IL-24有可能成为一种针对GMC增生的基因治疗方法。

简介：摘要目的探讨护理干预对重组人P53腺病毒联合放化疗治疗的鼻咽癌患者癌因性疲乏和生存质量的影响。方法60例采用重组人P53腺病毒联合放化疗治疗的鼻咽癌患者随机分为两组，对照组进行常规护理，观察组在常规护理的基础上，由专业护士实施护理干预。在治疗开始及结束时，60例患者均采用BFI量表及EORTCQLQ-C30量表进行调查，结果用统计学方法对两组患者癌因性疲乏、生存质量进行比较分析。结果治疗开始时，实验组与对照组癌因性疲乏、生存质量无显著性差异；治疗结束时,观察组疲乏程度低于对照组,生存质量高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。结论健康宣教、心理干预、有氧运动、饮食调养，提高睡眠质量等护理干预，可以消除或缓解疲乏程度,提高患者的生存质量。

简介：摘要目的了解2014年湖南省C亚属人腺病毒(HAdV-C)分离株的基因特征。方法2014年从湖南省长沙市严重急性呼吸道感染儿童病例咽拭子标本中分离到一株HAdV-C病毒株(Hunan2014-s024)，分段扩增目的基因片段，拼接后获得全基因组序列，同时下载GenBank数据库中国内外流行的HAdV-C代表株全基因组序列构建HAdV-C数据库，使用生物信息学软件进行全基因组序列特征分析。结果Hunan2014-s024株与2006年山西省健康儿童粪便标本中分离到的HAdV-C病毒株(MK041244-CHN-2006)的同源性最高，并以该病毒基因组元件为主要骨架，在penton base基因上交换了2012年湖南省急性下呼吸道感染患儿分离株(MK041246-CHN-2012)的基因片段。结论2014湖南株(Hunan2014-s024)为2006年山西省病毒株(MK041244-CHN-2006)与2012年湖南株(MK041246-CHN-2012)的重组病毒，由于其致病性可能发生了改变，因此有必要加强HAdV-C的分子流行病学监测，以了解其潜在疾病负担和公共卫生意义。

简介：摘要目的探讨重组人P53腺病毒联合后装放疗对早期巨块型宫颈癌的临床疗效分析。方法选取2008年1月～2010年1月间，Ⅰb～Ⅱa期巨块型宫颈鳞癌患者共20例。分为两组。观察组9例（rAd-p53+后装放疗），对照组11例（单纯放疗）。观察肿瘤的的退缩情况、不良反应等。结果观察组有效率82.35%,对照组有效率45.45%，两组比较差异有统计学意义。rAd-p53的主要不良反应为自限性发热，无明显毒副反应。结论rAd-p53瘤内注射联合后装放疗对早期巨块型宫颈鳞癌在治疗方面是有小的、安全的。

简介：摘要目的探讨重组腺病毒缺氧诱导因子-1α(AdHIF-α1)在大鼠缺氧脑微血管内皮细胞(BMEC)中的转染情况，为AdHIF-1α治疗缺氧的BMEC提供理论基础。方法建立大鼠BMEC的体外分离培养及鉴定，并用含100 μmol/L二氯化钴(CoCl2)的维持培养液培养，制成BMEC缺氧模型；然后将AdHIF-1α转染入缺氧的BMEC中，在荧光显微镜下观察荧光蛋白的转染情况。结果AdHIF-lα转染入缺氧的BMEC后，分别在12 h、24 h、48 h、72 h于荧光显微镜下观察AdHIF-lα的转染情况，结果显示，12 h开始出现少许荧光，光密度值(A值)0.13±0.01；24 h荧光表达有所增强，A值0.46±0.03；48 h荧光表达最明显，A值0.97±0.05；72 h可见荧光减弱，A值0.38±0.02；不同时间点比较差异有统计学意义，两两比较结果显示，相邻时间点A值比较差异均有统计学意义(q＝25.88、40.00、46.28，均P<0.01)。结论重组腺病毒缺氧诱导因子-1α能成功转染至缺氧的BMEC。

简介：目的探讨腺病毒载体介导转铁蛋白受体报告基因（TFRC）转染人结直肠癌Lovo细胞的最佳感染复数（MOI）、目标基因表达情况及体外MR成像情况。方法采用介导转铁蛋白受体报告基因的腺病毒（Ad-TFRC）载体以5、10、50、100的MOI转染Lovo细胞,以实时定量PCR检测相应mRNA表达。以浓度不一的转铁蛋白（Tf）-超微超顺磁性氧化铁（USPIO）探针转染细胞后,经普鲁士蓝染色确定最佳浓度,并以台盼蓝染色评价细胞活力。采用7.0TMR以T2、T2map及T2~＊map序列对目标细胞成像,分析信号强度差异。结果Ad-TFRC成功转染Lovo细胞,最佳MOI值为50,感染效率〉90%;实时定量PCR检测显示Ad-TFRC转染Lovo细胞中TFRC蛋白表达量较空白对照Lovo细胞增多（P〈0.01）;普鲁士蓝染色结果示探针铁浓度为1.5μg/ml时最佳,Lovo细胞内可见大量蓝染铁颗粒;探针标记的Lovo细胞及空白对照Lovo细胞盼蓝染色拒染率分别为（93.80±1.60）%和（95.10±2.30）%,差异无统计学意义（P〉0.05）;体外MRT2W、T2map及T2~＊map成像显示,与空白对照Lovo细胞比较,探针标记的Lovo细胞信号强度减弱（P〈0.05）。结论腺病毒载体可在Lovo细胞中高效表达转铁蛋白受体报告基因,磁化标记后可成功实现Lovo细胞的体外7.0TMR显像。

简介：摘要目的观察低氧条件下缺氧反应元件(HRE)与肿瘤特异性细胞增殖相关核抗原Ki-67(MKI67)启动子构成的嵌合型启动子调控的溶瘤腺病毒在肾癌细胞中的增殖能力和杀伤作用。方法将HRE序列作为增强子嵌合至肿瘤特异性强的Ki-67启动子上游，同时携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，构建溶瘤腺病毒Ad-HRE-Ki-67-EGFP，组织半数感染剂量法(TCID50)测定滴度；两种病毒分别在常氧(21%O2)和低氧(1%O2)条件下感染正常肾上皮细胞人肾小管上皮细胞(HK-2)和肾癌细胞人肾细胞腺癌细胞(OSRC-2)、人肾腺癌细胞(ACHN)，24 h后荧光显微镜及流式细胞仪检测病毒的靶向性；蛋白质印迹法(Western blot)检测低氧条件下细胞中低氧相关蛋白缺氧诱导因子(HIF)-1α、血管内皮生长因子(VEGF)的表达；细胞计数试剂盒(CCK-8)检测病毒对细胞的杀伤能力。应用SPSS 19.0统计软件分析，组间均数比较采用t检验。结果成功构建重组溶瘤腺病毒Ad-HRE-Ki-67-EGFP；Ad-HRE-Ki-67-EGFP感染肾癌细胞ACHN和OSRC-2，常氧条件下Ad-HRE-Ki-67-EGFP的感染效率分别为(47.5±2.6)%和(35.2±3.4)%，低氧条件下分别为(86.4±3.4)%和(73.5？±2.3)%，即低氧条件下感染效率更高(ACHN：t＝15.760；OSRC-2：t＝16.190；P<0.01)；正常肾小管上皮细胞HK-2在常氧条件下Ad-Ki-67-EGFP、Ad-HRE-Ki-67-EGFP两种病毒的感染效率为(22.4±3.1)%和(22.9±2.2)%，与肾癌细胞ACHN、OSRC-2比较(ACHN：(68.4±3.3)%和(72.1±2.9)%；OSRC-2：(56.1±3.1)%和(61.4±2.3)%)，差异有统计学意义(Ad-Ki-67-EGFP：t＝17.650、13.390；Ad-HRE-Ki-67-EGFP：t＝23.680、21.430，P<0.01)，说明2种腺病毒对肾癌细胞具有靶向性；Western blot结果显示低氧条件下缺氧诱导因子HIF-1α、血管内皮生长因子VEGF、p53蛋白的表达增多且表现为时间依赖性，说明低氧可以调节HIF-1α、VEGF、p53蛋白的转录及翻译水平；在低氧条件下，感染Ad-HRE-Ki-67-EGFP的两种肿瘤细胞的早期区域1A(E1A)蛋白表达水平明显高于Ad-Ki-67-EGFP感染后的水平；CCK-8结果显示在感染复数(MOI)值为MOI＝20、100时，ACHN和OSRC-2细胞中Ad-HRE-Ki-67-EGFP-normoxia病毒组细胞的存活率为(73.4±2.0)%、(56.4±1.5)%和(79.9±1.8)%、(61.3±2.7)%，Ad-HRE-Ki-67-EGFP-hypoxia病毒组为(63.1±2.0)%、(31.6±2.1)%和(68.1±2.6)%、(35.8±3.1)%，Ad-HRE-Ki-67-EGFP-hypoxia病毒组表现出更强的增殖抑制作用[MOI(20)：t＝6.328、6.441；MOI(100)：t＝16.410、10.790，P<0.01]。结论在低氧条件下，嵌合HRE序列的重组溶瘤腺病毒在肾癌细胞中具有更强的复制能力和细胞杀伤作用。

简介：摘要目的研究两种支原体快速检测方法在病毒载体制品中的适用性和影响因素。方法采用基于PCR技术的两种支原体核酸扩增检测方法，对分别表达Ⅱ型单纯疱疹病毒抗原gD和ICP27的重组仙台病毒载体疫苗(SeV-dF/HSV-2 gD、SeV-dF/HSV-2 ICP27)收获液及纯化液进行支原体检测，探究其特异性和最低检测限，并对多个批次的收获液及纯化液进行测定。结果普通PCR法在对本制品病毒收获液检测时无明显PCR抑制现象，但对病毒纯化液检测时发生明显的PCR抑制，并且未能检出100 CFU/ml限度的口腔支原体和肺炎支原体。实时荧光定量PCR法在对本制品病毒收获液和纯化液的支原体检测中均无PCR抑制发生，且该方法对口腔支原体、肺炎支原体等多种支原体的检测灵敏度可达到10 CFU/ml，其中对口腔和肺炎支原体核酸拷贝数检测灵敏度可达到每毫升50基因组拷贝。结论实时荧光定量PCR法具有更高特异性和灵敏性，适用于作为质量内控方法快速检测病毒载体制品，及时发现支原体的污染，保证制品质量。

简介：摘要目的构建跨膜蛋白(transmembrane protein，TMEM)240慢病毒载体，并在人神经母细胞瘤细胞中表达。方法提取人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的RNA，逆转录成cDNA并作为模板，聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增TMEM240的CDS序列，与pLVX-EGFP-N1载体连接，转化、验菌送公司测序，pLVX-TMEM240-EGFP-N1质粒与慢病毒包装质粒共转染293Ta细胞，收取上清，感染SH-SY5Y，嘌呤霉素筛选，获得表达TMEM240的SH-SY5Y细胞，将感染pLVX-EGFP-N1的SH-SY5Y细胞作为对照组，感染pLVX-TMEM240-EGFP-N1的SH-SY5Y细胞为实验组。通过共聚焦显微镜、实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR，Real-time PCR)和Western blot检测细胞中TMEM240表达。结果测序结果显示pLVX-TMEM240-EGFP-N1质粒构建成功；共聚焦显微镜下，表达TMEM240的细胞内出现点状绿色荧光；Real-time PCR及Western blot结果表明细胞内TMEM240表达。结论成功构建TMEM240慢病毒载体，慢病毒在基因和蛋白水平均引起TMEM240表达升高。

简介：摘要目的通过构建过表达IL-35的慢病毒载体，转染鼻咽癌细胞，建立稳定表达IL-35的鼻咽癌细胞株，为进一步研究IL-35对鼻咽癌细胞的影响奠定基础。方法根据GenBank中的EBI3和IL-l2p35基因序列，设计引物克隆EBI3和IL-l2p35基因。PCR产物和pLVX-IRES-ZsGreenl质粒（命名为H145）经过经酶切、转化、筛选、测序鉴定等后获得重组质粒pLVX-mIL-35-IRES-ZsGreenl，命名为H11864。将重组质粒H11864和H145经过慢病毒包装后转染HEK-293T细胞，收取病毒浓缩液并检测其滴度。用病毒浓缩液感染CNE细胞，用Real-time PCR和ELISA检测IL-35的表达情况。检测IL-35过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响。结果测序结果显示，本研究成功构建重组质粒pLVX-mIL-35-IRES-ZsGreenl。pCDH-GFP组及pCDH-IL-35-GFP组的慢病毒滴度分别为5.10×108 TU·ml-1和1.03×109 TU·ml-1。Real-time PCR检测结果显示，与CNE-H11864（4 626 159.23±246 221.40）相比，CNE-H145（1.22±0.77）和CNE（0.80±0.65）中IL-35的mRNA表达量显著较低（均P<0.01）。ELISA检测显示，CNE-H11864中IL-35的蛋白含量为344.84 pg/ml，与CNE-H145的33.00 pg/ml相比，显著增高（P<0.01）。CCK-8检测结果表明，与空白组和质粒对照组相比，CNE-H11864组在转染72 h后吸光度值明显升高（均P<0.05），并且在96 h进一步升高（均P<0.01）。结论本研究成功构建稳定表达IL-35的鼻咽癌细胞株，IL-35蛋白能够促进人鼻咽癌细胞的增殖能力。