简介:摘要目的探讨自噬抑制剂Spautin-1对小鼠创伤性颅脑损伤(TBI)后焦虑样行为的影响及其机制。方法36只C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为假手术组、TBI组、TBI+自噬抑制剂Spautin-1组,每组12只。后2组小鼠采用改良的Feeney自由落体硬膜外撞击法建立TBI模型。造模后10 min,TBI+自噬抑制剂Spautin-1组小鼠侧脑室注射2 μL Spautin-1溶液(10 mmol/L),另外2组注射等量溶剂。造模后1、7、14 d采用神经系统症状评分(NSS)评估小鼠的运动、感觉和反射功能。造模后15、16 d分别采用旷场实验、高架十字迷宫实验评估小鼠的焦虑样行为。造模后16 d采用尼氏染色检测小鼠杏仁核区尼氏小体的数量,免疫荧光染色检测小鼠杏仁核区神经元特异性核蛋白(NeuN)阳性细胞数、白细胞介素(IL)-18及IL-1β阳性星形胶质细胞数,Western blotting实验检测小鼠杏仁核区自噬、焦亡相关蛋白的表达。结果(1)造模后1、7 d,与假手术组比较,TBI组、TBI+自噬抑制剂Spautin-1组小鼠的NSS评分增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)造模后15、16 d,与假手术组比较,TBI组、TBI+自噬抑制剂Spautin-1组小鼠旷场实验的跨格次数、中央区停留时间百分比下降,高架十字迷宫实验的进入开放臂次数(OE)百分比、开放臂停留时间(OT)百分比下降;与TBI组比较,TBI+自噬抑制剂Spautin-1组小鼠的跨格次数、中央区停留时间百分比、OE百分比、OT百分比升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)与假手术组比较,TBI组、TBI+自噬抑制剂Spautin-1组小鼠杏仁核区尼氏小体、NeuN阳性细胞数减少;与TBI组比较,TBI+自噬抑制剂Spautin-1组小鼠杏仁核区尼氏小体、NeuN阳性细胞数增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)与假手术组比较,TBI组、TBI+自噬抑制剂Spautin-1组小鼠杏仁核区IL-1β、IL-18阳性星形胶质细胞百分比增加;与TBI组比较,TBI+自噬抑制剂Spautin-1组小鼠杏仁核区IL-1β、IL-18阳性星形胶质细胞百分比减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。(5)与假手术组比较,TBI组、TBI+自噬抑制剂Spautin-1组小鼠杏仁核区NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、成孔蛋白D-N末端片段(GSDMD-N)、泛素特异性肽酶(USP)13及B淋巴细胞瘤-2相互作用蛋白(Beclin1)的表达上调,微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ值升高;与TBI组比较,TBI+自噬抑制剂Spautin-1组小鼠杏仁核区NLRP3、活化Caspase-1、GSDMD-N、USP13、Beclin1蛋白的表达下调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论自噬抑制剂Spautin-1能够改善小鼠TBI后的焦虑样行为,其机制可能与抑制小鼠杏仁核区星形胶质细胞的自噬依赖性焦亡相关。
简介:摘要目的初步探讨转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor beta-activated kinase 1,TAK1)对缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)中小胶质细胞焦亡的调控作用。方法分离胎鼠原代小胶质细胞,随机分为4组接受不同处理,分别为对照组、5z-7-oxozeaneol(5z-7)组、氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)组和OGD+5z-7组,其中5z-7为小分子TAK1抑制剂。应用分子生物学及形态学方法对处理后的0 h、6 h及24 h各组磷酸化TAK1(phosphorylated TAK1,P-TAK1)水平及NOD样受体家族蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP-3)、凋亡相关点状蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)寡聚体、Gasdermin D-N端(GSDMD-N)、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)等焦亡相关蛋白表达水平与乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)及小胶质细胞焦亡水平进行检测和比较。结果(1)与对照组相比,OGD组0 h上述蛋白表达水平及LDH值差异无统计学意义(P>0.05),6 h、24 h时P-TAK1水平降低,NLRP-3、ASC寡聚体、GSDMD-N、IL-1β、LDH水平升高(P<0.05),电镜下见小胶质细胞胞膜连续性破坏、胞浆溢出、核内染色质边聚等焦亡表现;(2)5z-7组、OGD+5z-7组6 h、24 h P-TAK1水平分别低于对照组、OGD组,而NLRP-3、ASC寡聚体、GSDMD-N、IL-1β、LDH水平升高(P<0.05)。结论TAK1磷酸化水平的下调对HIBD中小胶质细胞的焦亡具有促进作用,且该作用与上调NLRP-3的表达及ASC的寡聚化水平有关。
简介:摘要目的探讨Caspase-1/焦孔素D(gasdermin D,GSDMD)介导的细胞焦亡在三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)顺铂(DDP)抗肿瘤效应中的作用。方法采用HE染色和免疫组化染色检测以DDP为基础的新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy,NACT)前后TNBC组织的形态学改变及焦亡/凋亡通路相关蛋白的表达变化。在TNBC细胞系MDA-MB-231细胞中给予DDP处理,观察细胞形态学改变。采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术分析DDP诱导的细胞死亡类型。采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验和ELISA实验检测DDP给药后细胞培养上清液中释放的LDH及分泌的炎性因子IL-18、IL-1β的变化。采用蛋白质印记检测DDP给药后细胞中焦亡/凋亡通路相关蛋白的表达变化。在DDP给药的MDA-MB-231细胞中同时给与Caspase-1特异性抑制剂抑制焦亡效应,或给与Caspase-3特异性抑制剂抑制凋亡效应,通过MTT、克隆形成实验、transwell、细胞划痕实验检测对DDP抗肿瘤效应的影响。结果以DDP为基础的NACT引起的TNBC患者肿瘤组织病理学改变包括癌细胞肿胀和瘤床周围炎性细胞聚集,更类似于焦亡样改变。焦亡途径关键分子Caspase-1和GSDMD在NACT后上调幅度均显著高于主导细胞凋亡的Caspase-3上调水平。进一步的细胞实验显示,DDP可诱导MDA-MB-231细胞呈现以细胞膜吹泡为特征的焦亡样改变。基于Annexin V-PI的流式细胞学显示DDP引起的MDA-MB-231细胞死亡类型主要为Annexin V+PI+细胞(裂解型细胞为主,如焦亡)。此外,DDP能诱导MDA-MB-231中Caspase-1和GSDMD的显著切割活化,同时上调上清液中LDH、IL-18和IL-1β的释放,而主导凋亡的Caspase-3活化水平明显低于Caspase-1、GSDMD。且Caspase-1抑制剂(阻断经典的焦亡途径)对顺铂抗肿瘤效应的抑制作用明显大于Caspase-3抑制剂(阻断凋亡途径)。结论Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡在三阴性乳腺癌DDP抗肿瘤效应中可能发挥主导作用。
简介:摘要目的探讨外源性左旋肉碱对过度内质网应激介导的严重烫伤大鼠肝细胞焦亡的影响及其分子机制。方法采用实验研究方法。将15只6~8周龄雌性SD大鼠按随机数字表法(分组方法下同)分为假伤组、单纯烫伤组、烫伤+肉碱组,每组5只,单纯烫伤组和烫伤+肉碱组大鼠背部制作30%体表总面积的Ⅲ度烫伤,其中烫伤+肉碱组大鼠另外给予腹腔注射左旋肉碱。伤后72 h,采用全自动生化仪检测肝损伤生物化学指标天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平,样本数为5。伤后72 h,采用苏木精-伊红染色观察肝组织损伤情况。伤后72 h,采用实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)法检测肝组织中细胞焦亡相关标志物核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、消皮素D和白细胞介素1β(IL-1β)以及内质网应激相关标志物葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的mRNA水平;采用蛋白质印迹法检测肝组织中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平,样本数均为5。取人肝癌细胞HepG2,分为二甲基亚砜(DMSO)组、0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组,分别作相应处理。培养24 h后,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞活力并筛选衣霉素干预浓度(样本数为5)。取HepG2人肝癌细胞,分为DMSO组、单纯衣霉素组和衣霉素+肉碱组,分别作相应处理。培养24 h后,采用蛋白质印迹法检测细胞中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平,样本数均为3。对数据行单因素方差分析和LSD-t检验。结果伤后72 h,单纯烫伤组大鼠血清中AST和ALT水平分别为(640±22)、(157±8)U/L,均分别明显高于假伤组的(106±13)、(42±6)U/L(t值分别为-46.78、-25.98,P<0.01);烫伤+肉碱组大鼠血清中AST和ALT水平分别为(519±50)、(121±10)U/L,均明显低于单纯烫伤组(t值分别为4.93、6.06,P<0.01)。伤后72 h,假伤组大鼠肝组织形态基本正常,未见明显的炎症细胞浸润;与假伤组相比,单纯烫伤组大鼠肝组织可见大量的炎症细胞浸润,细胞排列紊乱;与单纯烫伤组相比,烫伤+肉碱组大鼠肝组织可见少量的炎症细胞浸润。伤后72 h,单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1β mRNA表达水平均明显高于假伤组(t值分别为34.42、41.93、30.17、15.68,P<0.01);烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1β mRNA表达水平均明显低于单纯烫伤组(t值分别为34.40、37.20、19.95、7.88,P<0.01)。伤后72 h,与假伤组相比,单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显升高(t值分别为12.28、26.92、5.20、10.02、24.78,P<0.01);与单纯烫伤组相比,烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显下降(t值分别为10.99、27.96、12.69、8.96、12.27,P<0.01)。伤后72 h,单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显高于假伤组(t值分别为21.00、16.52,P<0.01),烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显低于单纯烫伤组(t值分别为8.92、8.21,P<0.01);单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显高于假伤组(t值分别为22.50、14.29,P<0.01),烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显低于单纯烫伤组(t值分别为14.29、5.33,P<0.01)。培养24 h后,与DMSO组相比,0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组细胞存活率均明显下降(t值分别为4.90、9.35、18.64、25.09,P<0.01);选择0.8 μmol/L作为后续衣霉素的干预浓度。培养24 h后,与DMSO组相比,单纯衣霉素组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显升高(t值分别为10.48、17.67,P<0.01);与单纯衣霉素组相比,衣霉素+肉碱组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显下降(t值分别为8.08、13.23,P<0.05或P<0.01)。培养24 h后,与DMSO组相比,单纯衣霉素组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显升高(t值分别为13.44、27.51,P<0.01),caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05);与单纯衣霉素组相比,衣霉素+肉碱组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显下降(t值分别为20.49、21.95,P<0.01),caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05)。结论在严重烫伤大鼠中,外源性左旋肉碱可能通过抑制过度内质网应激介导的细胞焦亡相关通路发挥对肝损伤的保护作用。
简介:摘要目的探讨蛋白激酶Cβ2 (protein kinase Cβ2, PKCβ2)在高糖与缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, HR)诱导的心肌细胞焦亡中的作用。方法将培养的H9c2心肌细胞按随机数字表法分为5组(每组6孔):低糖组(LG组)、低糖缺氧/复氧组(LG+HR组)、高糖组(HG组)、高糖缺氧/复氧组(HG+HR组)、高糖缺氧/复氧+PKCβ2抑制剂CGP53353 (1 µmol/L)治疗组(HG+HR+CGP组)。采用三气培养箱(5%CO2、94%N2、1%O2)缺氧4 h,正常氧浓度复氧2 h构建细胞HR模型,细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK8)检测细胞存活率,ELISA法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平,Western blot法检测细胞PKCβ2及焦亡相关蛋白Nod样受体蛋白-3 (Nod-like receptor pyrin domain3, NLRP3)、IL-1β、半胱氨酸蛋白酶-1 (caspase-1)表达水平,JC-1染色评估H9c2细胞线粒体膜电位水平。结果与LG组比较,HG组、LG+HR组、HG+HR组细胞存活率明显降低而LDH释放水平明显增加(P<0.05),同时伴随PKCβ2活化及NLRP3、IL-1β、caspase-1表达上调(P<0.05);与HG组比较,HG+HR组LDH释放水平增加,细胞存活率明显降低(P<0.05),JC-1单体细胞百分比及磷酸化PKCβ2 [phospho-PKCβ2 (Ser660), P-PKCβ2]蛋白、NLRP3、IL-1β、caspase-1表达上调(P<0.05);与LG+HR组比较,HG+HR组LDH释放水平增加,细胞存活率明显降低(P<0.05),P-PKCβ2表达明显增加,NLRP3、IL-1β、caspase-1表达上调(P<0.05)。与HG+HR组比较,HG+HR+ CGP组细胞存活率明显增加,LDH释放水平、JC-1单体细胞百分比、P-PKCβ2、NLRP3、IL-1β、caspase-1表达下调(P<0.05)。结论选择性抑制PKCβ2过度活化可减轻心肌细胞高糖HR性损伤,其机制可能与降低细胞焦亡水平及减轻线粒体损伤有关。