番泻叶口服液微生物限度检查方法的建立

番泻叶口服液微生物限度检查方法的建立

董瑞

董瑞

（成都市食品药品检验研究院四川成都610041）

【摘要】目的:建立番泻叶口服液的微生物限度检查方法。方法:测定番泻叶口服液对5种试验菌的回收率，确定适宜的检测方法，并对控制菌的检查方法进行验证。结果:采用常规法检查，供试品对5种试验菌的人工染菌回收率均高于70%。控制菌阳性对照菌生长良好。结论:此方法可用于番泻叶口服液微生物限度检查。

【关键词】番泻叶口服液；微生物限度检查；方法验证

【中图分类号】R93【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）32-0393-03

ValidationofmicrobiallimittestmethodoffoliumsennaeDONGRuiChengduinstitutefordrugcontrol,Chengdu,610041,China

【Abstract】OBJECTIVEToestablishamethodforthemicrobiallimittestoffoliumsennae.METHODSTheinspectionmethodwastestedbydeterminationofrecoveryrateoffivedifferentbacterialinfoliumsennae.Andvalidationwasperformedoncontrolbacterial.RESULTSTheroutinemethodwasfeasibleaccordingtothetsetoffivekindsofbacterialwithrecoveryrateover70%.Thepositivecontrolbacterialgrewwell.CONCLUSIONThismethodcanbeusedformicrobiallimittestingoffoliumsennae.

【Keywords】foliumsennae;microbiallimittest;validation

番泻叶的主要成分是蒽醌类衍生物，有效成分番泻苷A、B吸收后分解成具有泻下活性的主要产物大黄酸茵酮[1-5]，直接兴奋骨盆运动神经节而使大肠收缩，加速肠蠕动，促进粪便排出；番泻总苷能改变细胞膜对离子的通透性，使水、钠吸收减少，通过增加肠腔内容积继而刺激肠壁反射性地使小肠和结肠的蠕动增强，从而产生腹泻作用[6]。

番泻叶口服液为口服给药制剂。按照《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法标准规定，本品细菌数每1mL不得过100cfu，霉菌和酵母菌数每1mL不得过100cfu，大肠埃希菌每1mL不得检出。本品在进行微生物限度检查时，应建立适合于本品的方法。为了确证方法的有效性，按《中国药典》2010年版要求，对番泻叶口服液微生物限度检查法进行了方法验证[7]。

1.材料

1.1仪器

洁净工作台（苏净集团安泰公司）、电热恒温水浴箱（上海医疗器械七厂）、隔水式恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、LRH250生化培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）

1.2菌种

大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均来源于中国药品生物制品检定所，均为第4代培养物。

1.3培养基及试剂

营养肉汤培养基改良马丁培养基营养琼脂培养基

改良马丁琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基胆盐乳糖培养基

0.9％无菌氯化钠溶液pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液

以上培养基均由北京三药科技开发公司生产，按标签说明进行配制。

1.4实验样品

番泻叶口服液（批号：131217140225140301）

2.方法与结果

2.1细菌数计数方法的验证

2.1.1常规法测定细菌数的方法验证

2.1.1.1菌液制备取经35℃培养22h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100cfu/mL的菌悬液，做活菌计数备用；

2.1.1.2供试液制备取本品10mL，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100mL，混匀得1:10供试液。

2.1.1.3回收率测定

2.1.1.3.1供试品对照组取1:10供试液1mL，平行制备2个平板，测定供试品本底细菌数；

2.1.1.3.2菌液组分别取上述3种试验菌悬液1mL，注入平皿，每株试验菌平行制备2个平皿，倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，测定所加的试验菌数。

2.1.1.3.3试验组取1:10供试液1mL和大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液1mL，分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，35℃培养3天，计数；

2.1.1.4结果：三次独立的平行试验结果如下表所示

试验组菌回收率：(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液组菌数×100%。

由表1可以看出，本品采用常规法（1mL/皿）检查细菌数，在三次独立的平行试验中，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的人工染菌回收率均高于70%，因此，本品细菌计数可采用常规法（1mL/皿）。

2.2霉菌和酵母菌数计数方法的验证

2.2.1常规法测定霉菌和酵母菌数的方法验证

2.2.1.1菌液制备取经25℃培养24h的白色念珠菌改良马丁培养基培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100cfu/ml的菌悬液，做活菌计数备用；

取经25℃培养7d的黑曲霉菌改良马丁琼脂培养基斜面培养物，加5mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液（用管口带有薄的纱布的无菌毛细吸管吸出胞子悬液）至无菌试管中，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100cfu/ml的孢子悬液，做活菌计数备用。

2.2.1.2供试液制备取本品10mL，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100mL，混匀得1:10供试液。

2.2.1.3回收率测定

2.2.1.3.1供试品对照组取1:10供试液1mL，平行制备2个平板，测定供试品本底霉菌和酵母菌数。

2.2.1.3.2菌液组分别取上述2种试验菌悬液1mL，注入平皿，每株试验菌平行制备2个平皿，倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，测定所加的试验菌数。

2.2.1.3.3试验组取1:10供试液1mL和白色念珠菌、黑曲霉菌悬液1ml倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，25℃培养5天，计数。

2.2.1.4结果试验组菌回收率：(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液组菌数×100%

从表2可以看出，本品采用常规法检查霉菌和酵母菌数，在三次独立的平行试验中，供试品对白色念珠菌和黑曲霉的人工染菌回收率均高于70%，因此，本品霉菌和酵母菌计数可采用常规法（1mL/皿）。

2.3控制菌检查方法的验证

2.3.1大肠埃希菌检查方法的验证

2.3.1.1供试液制备

取本品10mL，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，混匀得1:10供试液。

2.3.1.2菌液制备

取经35℃培养22h的大肠埃希菌的营养肉汤培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100cfu/mL的菌悬液，做活菌计数备用；

2.3.1.3常规法检查大肠埃希菌

2.3.1.3.1试验组

取1:10供试液10mL及制备好的大肠埃希菌悬液1mL加入到100mL的胆盐乳糖培养基中，35℃培养22小时。吸取0.2mL培养物接种至5mLMUG培养基中，35℃培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，观察颜色变化。

2.3.1.3.2阳性对照组

取制备好的大肠埃希菌菌悬液1mL加入到100mL的胆盐乳糖培养基中培养，其他操作同2.3.1.3.1。

2.3.1.3.3供试品对照组

取1:10供试液10mL加入到100mL胆盐乳糖培养基中，其他操作同2.3.1.3.1。

2.3.1.3.4阴性对照组取10mLpH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液加入到100mL胆盐乳糖培养基中，其他操作同2.3.1.3.1。

2.3.1.3.5结果

由表3可知，阴性对照组和供试品对照组中，紫外灯下观察和靛基质反应均呈阴性，而试验组加入大肠埃希菌培养后，366nm紫外下呈现荧光，且加入靛基质后，液面呈玫瑰红色，都和阳性对照组一样。因此，本品大肠埃希菌可采用常规法（胆盐乳糖培养基100mL）进行检查。

3.讨论

本品可采用常规法进行细菌计数、霉菌和酵母菌计数以及控制菌的检查。根据验证结果将微生物限度检查方法记录如下：取本品10mL，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100mL，摇匀，得1:10供试液。细菌计数、霉菌和酵母菌计数以及控制菌均采用常规法进行检查（中国药典2010年版一部附录），应符合规定。

【参考文献】

[1]高宾,赵丹.番泻叶的鉴剐[J].首都医药.2011.07(上):46

[2]赵乃才,吴银生,肠内菌丛对和汉药成分的代谢[J].国外医学(中医中药分册),1984,(3):22—26．

[3]匡海学．和汉药成分在肠内菌丛作用下的代谢——番泻甙及甘草酸的代谢[J].国外医学(中医中药分册),1984,(2):52—53．

[4]小桥恭一.肠内细菌对大黄成分的代谢[J]．国外医学(中医中药分册)，1983，(3)：50—51．

[5]宏全．关于番泻苷C在肠管内活化的研究[J]．国外医学(中医中药分册)，1981，(2)：48．

[6]沈映群．中药药理学[M]．北京：人民卫生出版社，2000：34

[7]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：附录79．