miRNA检测方法的研究

miRNA 检测方法的研究

肖宇洁 王坦彬 山东协和学院

摘要：miRNA在基因调控方面起着重要作用，其异常表达和特异性表达提示其可成为诊断或预后的生物标志物。因此准确测定其表达水平对于其应用十分关键。但是由于miRNA序列短，同源序列相似度高，含量低，缺乏能够使其选择性扩增的共同特征，使得检测miRNA十分具有挑战性。本文对近年来miRNA的检测方法进行了概述，包括传统方法及其改进进展，以及一些新的检测方法，并对这些方法的优缺点进行了总结。

关键词：miRNA检测方法；RNA印迹；实时定量PCR（qRT-PCR）；探针

一、前言

本文综述了用于miRNA检测的一些常规技术，包括标准PCR、RNA印迹和微阵列方法，以及一些新的检测技术。这些方法有助于阐明 miRNA 在体内的生物发生过程和生物学功能。

二、检测方法

（一）RNA印迹法

RNA印迹（Northern blotting）是系统性分析miRNA表达最早的方法尝试，广泛用于可视化检测各种大小的miRNA表达，包括从长的原始miRNA到成熟形式的 miRNA。该技术能够检测目标miRNA的表达水平（半定量），确定它们的长度以及验证预测的miRNA。其一般步骤如下：含有miRNA的样品在电泳凝胶上分离，再将凝胶上的RNA转移到硝酸纤维素膜上，然后通过与靶miRNA互补的荧光或放射性标记的探针杂交，最后通过荧光或放射性元素检测信号。尽管RNA印迹通量低，灵敏度低，并且耗时和样本消耗量大，但是它依旧被广泛作为新检测方法验证的金标准。

（二）实时定量PCR

实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）是目前定量基因表达的金标准。qRT-PCR具有高敏感性、准确性和实用性，是生命科学中比较表达分析的一种强大技术。然而，对于一个平均长度为22nt的miRNA，设计常规PCR检测方法仍是一个挑战。基于qRT-PCR的miRNA分析的主要步骤为将miRNA逆转录成cDNA，然后通过qPCR实时监测反应产物积累。该技术平衡了检测成本、精密度和样品量，常用于miRNA的表达水平分析和验证其他方法获得的结果（如微阵列和RNA印迹分析）。

qRT-PCR方法的发展使得miRNA检测的灵敏度提高到只需要几纳克总RNA。但是，必须考虑到RNA完整性、cDNA合成、引物设计、扩增子检测和标准化等几个参数，才能获得有意义且可重复的结果。多家制造商提供了qRT-PCR试剂盒，可以评估数百种miRNA，并且一些方法还可以提供可定制的分析方法。采用阵列/qRT-PCR 定量在体液循环中（如血浆）的miRNA需要添加“内标”来标准化。对于qRT-PCR，更大的问题是用于miRNA 测定的标准化。大多数归一化曲线依赖于小RNAs的基因，这些基因可能不会被相同的聚合酶转录，并且不太可能代表一般的miRNA调控。另一种标准化技术使用每个样品中存在的平均 miRNA。然而，所选参考值在样本间是否保持恒定也是未知的。

用于miRNA检测的qRT-PCR技术的发展主要集中在互补DNA（cDNA）合成的创新。

（三）微阵列

在用于miRNA表达分析的技术中，基于微阵列的检测对高通量分析多组miRNAs特别有效。然而，需要进一步验证以更准确地量化miRNA的表达水平。微阵列基本原理是基于靶miRNA分子与其相应的互补探针之间的核酸杂交。miRNA寡核苷酸探针通常具有氨基修饰的5’末端，通过氨基和自组装单层膜（self-assembling monolayer，SAM）之间的共价交联固定在载玻片上，形成即用型miRNA微阵列。提取出来的RNA用荧光染料标记，然后与微阵列探针杂交，标记的miRNA与相应探针特异性结合，再检测载玻片上不同位置的荧光信号。因此，可以通过分析荧光信号强度来评估研究样品中miRNA的类型及其相对量。由于miRNA的序列短且丰度低，目前开发的基于微阵列的策略着眼于改进探针设计和miRNA标记。

一些文献已经报道了通过DNA微阵列来检测miRNA。然而，所有基于DNA的寡核苷酸微阵列平台的主要缺点是难以获得适用于全基因组的解链温度（Tm）标准化的探针组。为了解决这个问题，在miRNA微阵列中引入了锁核酸（LNA）修饰的捕获探针以达到Tm标准化。

（四）基于等温指数扩增的检测方法

等温扩增是寡核苷酸扩增的常用方法，主要是同时利用聚合酶和切口酶的活性。该技术利用位点特异性序列延伸和切口，指数生成和释放所需的延伸产物。通过这种方式，可以将微量的检测目标转化为大量的延伸产物。由于其等温性质，该技术相对于PCR具有快速扩增动力学和良好的扩增效率，无需专门的仪器。这种方法特别适用于miRNA的扩增。

（五）基于滚环扩增的检测方法

滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是另一种常用于扩增DNA和RNA的等温反应，并且具有良好的特异性和灵敏度。该方法特别适用于miRNA的检测，因为这些短链RNA是连接反应的理想模板，而模板恰恰是启动等温滚动循环放大过程的必须物。Jonstrup小组于2006年最早报道使用RCA进行miRNA检测。最近，Li的研究小组开发了一种将RCA与toehold介导链置换（TMSD）相结合的新方法，然后将其应用于原位miRNA检测。本研究中，将探针专门设计为哑铃形的密封探针，这种设计在TMSD和RCA中都起到了关键作用。将目标miRNA设计为启动TMSD过程的引物，当结合时导致探针发生结构改变。而RCA反应的启动取决于这种结构变化，否则它将保持非活动状态。此处如同之前的RCA反应，同样也使用Phi29DNA聚合酶。这种设计的另一个改进是其原位检测的可行性，由于其高效放大RCA，其显示比原位荧光杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）更好的灵敏度。

三、展望

miRNA在人类的发育、代谢和疾病过程中发挥重要作用。它们被视为细胞事件或早期疾病诊断的有用生物标志物。由于成熟的miRNA序列很短，只有大概19~25个核苷酸，并且其具有家族序列高度相似性以及低表达的特点，因此创建用于在复杂样品中快速、特异和灵敏检测miRNA的高效工具变得十分重要。包括RNA印迹、微阵列和qRT-PCR在内的常规miRNA检测技术对于筛选miRNA具有各自的优势。本文提供了一些常用的miRNA检测技术的优缺点以及它们的改进方案，也介绍了几种检测miRNA的新策略。目前已经有相当多的方法用来检测miRNA，但是作为临床常规生物标志物的检测，这些方法仍然存在相当大的局限性，这与miRNA本身的特征，以及检测的速度、成本相关。随着新技术新方法的不断发展，检测人员在miRNA的检测方面有了更多的选择，但必须综合考虑具体的试验目的和各种方法的优缺点，以获得最佳而又最经济的试验结果。要使miRNA作为标志物走向临床，其检测的标准化是关键。虽然目前方法众多，但是能够提供快速、准确、重复性好且绝对定量的方法仍然需要进一步的努力。

参考文献：

［1］辛鹤,王传卓,刘兆玉MicroＲNA－196a与肿瘤相关性的研究进展［J］实用肿瘤学杂志,2018,32(1):1-9．

［2］王薇,于宝丹,李玉莲,MicroＲNA－196b基因在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义［J］实用医院临床杂志,2016,13(5):61-64．

指导教师：迟双会 山东协和学院