菌粉残渣与发酵溶氧的关联性分析及调节措施

菌粉残渣与发酵溶氧的关联性分析及调节措施

郭新炯

杭州中美华东制药江东有限公司

摘要目的：以溶氧作为考察指标，通过调节不同发酵工艺，找出溶氧与残渣是否存在关联性。方法：使用AAS、ICP-MS对菌粉中金属离子含量进行检测，确定残渣的主要组成。使用二次补料的发酵工艺模拟生产过程，通过溶氧的变化和分段调控手段确定发酵液溶解氧与干重、残渣的关系，以期初步找出降低残渣的调控手段。结果：菌粉灰分中，钾离子浓度最高且与残渣呈一定线性关系，说明钾离子是影响残渣的主要因素。针对摇瓶发酵与生产罐残渣差异较大的现象，选择发酵溶氧作为考察因子，结果显示溶氧与残渣在一定范围内具有负相关性。对比不同的分段溶氧调控摇瓶发酵工艺，将调控时间选定为6天，前阶段转速为85rpm，后阶段转速135rpm对残渣降低有较好的效果，通过验证实验，调整后工艺与对照工艺相比可降低残渣9.05%。

关键字：发酵冬虫夏草  残渣  分段调控。

1. 引言

残渣是指药品经高温加热分解后遗留下不挥发的无机物，再经硫酸并炽灼后生成的金属氧化物或其硫酸盐，为表征药品金属离子含量的一个重要指标。根据生产及实验情况，菌粉残渣与干重、甘露醇含量有一定的关联性，查找残渣异常波动的因素是目前菌粉发酵的一个关键问题。

通过数据对比，摇瓶发酵样品与生产样品在相同的种子和培养基条件下菌粉残渣差异较大。可能原因是摇瓶发酵前期生长较慢，后期生长迅速，发酵放瓶的菌液较稀，由于存在的溶氧巨大差异及启动先后导致的pH的变化，可能会影响细胞膜的透性及离子选择性吸收，从而对残渣产生较大影响。本实验以摇瓶发酵为基础，通过溶氧的系列变化考察其与残渣的关联性，同时对降低残渣的发酵工艺做初步分析。

2. 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

实验所用菌种均为生产三级罐培养9、10天种子。

2.1.2 培养基及溶液

底料培养基：氮源A 0.3%；氮源B 0.25%；氮源C 0.75%；葡萄糖2.8%；MgSO4 0.01%；KH2PO4 0.02%。

补料培养基：氮源A 0.6%；氮源B 0.25%；氮源C 0.75%；葡萄糖2.8%；MgSO4 0.01%；KH2PO4 0.02%。

2.2 检测方法

2.2.1 干重

量取发酵液1000ml，通过150目滤布抽滤至基本无水滴下，105℃烘干至恒重称量。

2.2.2 甘露醇

参照2015版《药典》百令胶囊甘露醇含量检查方法。

2.2.3 残渣

参照2015版《药典》灼烧残渣检测法。

2.2.4 金属离子

委托检测机构检测，检测方法分别为原子吸收光谱法和ICP-MS。

2.3 试验方法

2.3.1 残渣与金属离子的关系

1、取不同水平残渣菌粉，使用原子吸收光谱法或ICP-MS检测K、Ca、Na、Mg等含量。

2、对比金属元素含量，查找影响残渣的主要金属元素。

2.3.2 溶氧与残渣关联性实验

1、无菌取四级罐移种后菌液，分装至5000ml无菌摇瓶中，初始装液量分别为300ml、450ml、600ml。

2、分别设置不同转速培养，培养至3、6天分别补料350ml、520ml、700ml。补料液来自生产补料罐。

3、每隔1-2天放瓶一组摇瓶，检测糖氮，菌片甘露醇、残渣等数据。

4、每隔1-2天同时取对应生产罐发酵液，检测糖氮，菌片甘露醇、残渣等数据。

5、选择不同转速及封口方式，验证溶氧与发酵干重及残渣的关系。

2.3.3 溶氧分段调节与残渣关系

1、无菌取四级罐移种料液，分装至无菌摇瓶中，初始装液量为600ml。

2、每组摇瓶分前后2段控制，前段培养时间分别设置为2、4、6天，后段培养时间分别为4、6、8天，前后2段培养中设置不同的转速。

3、培养至3、6天取生产液化料补料，补料量分别为450ml、450ml。

4、培养10天放瓶，抽滤烘干后检测干重及菌粉残渣、甘露醇等数据。

5、综合干重与残渣数据，挑选较合适的培养工艺。

3. 结果与分析

3.1 残渣与金属离子的关系

表1.不同发酵工艺菌粉所含金属元素含量

图1.残渣与钾离子线性关系

从表1看，菌粉灰分中，金属元素含量最多的钾离子，其次为镁离子、钠离子、钙离子。从图1看，钾离子与残渣呈一定的线性关系，根据含量和曲线可以初步判定钾为影响残渣的关键因素。

3.2 溶氧与残渣关联性实验

生产罐残渣的曲线在后期均高于摇瓶组，装液量相同，在选定的转速范围内（80、120、160），残渣随转速的升高而明显降低，三组中最高残渣（溶氧最低组）比最低残渣（溶氧最高组）分别高27%、42.8%、21.6%。转速相同，装液量与残渣关系在发酵后期有一定负相关性，说明溶氧的差异对残渣有较明显的影响，而且在摇瓶溶氧调节方面，转速比装液量效果更明显。

高溶氧、中溶氧组别随着转速的升高残渣均呈降低趋势。对于低溶氧组，当摇瓶转速在50~80rpm之间时残渣上升，高于80rpm后残渣下降，说明溶氧对残渣的影响并非线性关系，而是有一个残渣最高的溶氧区间，当溶氧高于或低于此水平时溶氧均下降。

3.3 溶氧分段调节与残渣关系

表2.主体间效应的检验（残渣）

从表2看，分段培养的时间节点对残渣影响不显著，第一阶段转速与第二阶段转速设定对残渣均有显著影响，尤其是第二阶段转速设定影响极显著。降低残渣的最佳组合为第一阶段培养6天，第二阶段培养4天，第一阶段转速85rpm，第二阶段转速135rpm，残渣相对最低。

图2.优化组与对照组发酵参数比较

从图2看，溶氧分段工艺与固定溶氧工艺（120rpm）相比，发酵相同时间，残渣降低9.05%，干重略有提升，说明优化后的摇瓶工艺在干重提升的前提下能较好的降低残渣水平。

4. 结论与讨论

针对生产罐和摇瓶发酵残渣差异较大的情况，对溶氧指标进行梯度考察，可以得出溶氧与残渣存在明显关系，在不影响菌丝发酵的溶氧水平上整体趋势为溶氧与残渣呈负相关性。通过溶氧分段调节实验，将发酵工艺分为两个阶段，前6天维持较低的溶氧水平，后4天将溶氧调节至高水平，可在不影响干重的前提下降低残渣9%。经检测分析，影响残渣的主要金属离子为钾离子。

本批次试验中，鉴于摇瓶发酵中溶氧调节水平的限制，不同水平组间差异难以有较大的区别，这会导致数据分辨率较低，实验结论与实际波动可能较大，后期需在此基础上，通过试验罐进行工艺调整。