银杏叶提取物（EGb-761）诱导MDA-MB-231细胞调亡的分子机制研究

银杏叶提取物（EGb-761）诱导MDA-MB-231细胞调亡的分子机制研究

刘培培1，冯赵慧子2*，严金玲1，曾雪亮1，潘静1，高畅1

赣南医学院第一附属医院药学部，江西 赣州市 341000 赣州市人民医院康复医学科，江西 赣州市 341000

［摘要］ 目的  基于PI3K/AKt信号通路研究银杏叶提取物（EGb-761）对MDA-MB-231细胞凋亡的分子机制。方法 用不同浓度的EGb-761处理MDA-MB-231细胞并分组，分别对应为低（656.25μg/mL）、中（1093.75μg/mL）和高浓度组（1531.25μg/mL），对照组为不含EGb-761的溶剂。检测细胞增殖、迁移、侵袭、形态变化和凋亡情况，wb实验检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达水平。结果 对照组及EGb-761低、中、高浓度组的抑制率（%）分别为0、27.28±5.66、48.05±4.90、80.30±4.00；迁移细胞数分别为379.40±27.46、348.80±17.08、288.00±16.23、224.00±11.38 ；侵袭细胞数分别为272.60±15.37、208.80±16.21、127.20±11.12、69.80±10.66；细胞凋亡率（%）分别为2.15±0.41,23.23±2.07，44.69±4.12,65.78±5.26，均呈剂量依赖性（P＜0.05）。观察细胞形态发现MDA-MB-231细胞经EGb-761处理后由密集分布的梭形状转化为分散的不规则球形或片块状。EGb-761处理后，细胞中PARP和PI3K的蛋白含量均降低，caspase-3含量升高，GSK3β和AKT蛋白磷酸化水平下降。结论 EGb-761可诱导人乳腺癌（MDA-MB-231）细胞凋亡，其分子机制可能与PI3K/Akt途径有关。

［关键词］：PI3K/Akt；EGB-761；人乳腺癌；增殖；凋亡

乳腺癌是一种常见与女性的肿瘤［1］，根据最新报告显示，2020年乳腺癌全球新发病例高达226万例，超越肺癌成为全球第一大癌症［2］。目前，对于乳腺癌转移的治疗一直没有明显的突破，临床上多采用手术治疗为主，放化疗辅助术后治疗，但治疗效果较为一般，经常发生肿瘤复发和转移的情况[3]，因此，寻找一种防治癌症的复发转移、降低放化疗毒副作用的抗癌药物十分必要。银杏叶提取物（extractofginkgobiloba，EGb-761）为传统中药材银杏叶中提取的活性成分，具有低毒高效的特点，已有学者将其用于治疗神经损伤、肝损伤以及肾代谢等疾病［4,5］，但银杏叶提取物对肿瘤尤其是人乳腺癌治疗效果的研究报道还较少，其分子机制尚不十分明确。PI3K/ Akt通路和细胞活动密切相关，已被研究证实与多种人类肿瘤存在关联，其活性异常会使细胞周期紊乱，导致正常细胞向肿瘤细胞转换[6,7]。本实验拟研究观察EGb-761对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的影响，并基于PI3K/ Akt通路探讨EGB-761抗肿瘤作用的机制，旨为EGb-761治疗乳腺癌的开发应用提供科学的理论支持。

1材料与方法

1.1细胞株与EGb-761

MDA-MB-231细胞（购自协和细胞库）； EGb-761（17.5mg/5mL，台湾济生化学制药厂股份有限公司，批号：M4073）。

1.2试剂与仪器

PMI1640培养基、青链霉素购自同田科技有限公司；蛋白胰酶购自GEN-VIEW科技有限公司；标准胎牛血清购自爱必信生物有限公司；MTT试剂盒、transwell小室、MatrigelMatrix基质胶、凋亡检测试剂盒购自美国Thermo公司； caspase-3、PARP、p-GSK3β、GSK3β、PI3K、p-Akt 、Akt和β-actin抗体及山羊抗兔IgG购自成都正能生物有限公司 ；Elx800酶标仪购自BioTek公司；Western 湿电转膜仪购自美国BD公司；S3e流式细胞仪购自美国Thermo公司；荧光倒置显微镜购自美国Leica公司。

1.3细胞培养及分组

MDA-MB-231细胞在培养基中（含10%胎牛血清， 1%的青链霉素），于37℃、5%CO2温箱中孵育，2~3天传代一次，3代后用于实验。根据银杏叶提取物EGb-761处理的浓度分为低（656.25μg/mL）、中（1093.75μg/mL）、高浓度组（1531.25μg/mL），以不含EGb-761的溶剂处理细胞为对照组。

1.4MTT法检测MDA-MB-231细胞抑制率

取对数期细胞，浓度控制为1×105个/mL。对照组和EGb-761组每孔加入100μL细胞悬浮液，调零组加培养基，小孔周围加PBS，于5%CO2，37℃培养箱中孵育24h。根据分组加药处理，调零组加等量培养基，继续培养24h。各组加MTT溶液20μL，继续孵育4h。吸出上清，每孔200μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解，上酶标仪测定各孔光OD

490nm值，记录结果并计算各复孔的细胞抑制率，每组设5个复孔。细胞抑制率=（OD对照-ODEGb-761）/（OD对照- OD调零）×100%。

1.5细胞迁移实验

取对数期细胞，0.25%胰酶消化，离心，重悬细胞，调整细胞密度为2×105/mL。按上述细胞分组处理，上室加入100μL处理好细胞悬液，下室加入含20%血清的培养基，放5%CO2，37℃培养箱中孵育24h。取出小室，吸去溶液，4%甲醛固定细胞10min，0.1％结晶紫染色10min左右，清洗。用棉签小心擦去上室底部膜表面上的细胞，取5 个方向随机视野，显微镜下计数，计算取平均值。

1.6细胞侵袭实验

取稀释的人工基质胶l25μl 加入transwell 板上室，平摊覆盖至膜上，然后在温箱中放置30min，使人工基质胶聚合。取对数期待测细胞，调整浓度为2×105 个/ml，上室接种处理后MDA-MB-231细胞悬液，下室用初始的培养基做趋化因子。后续步骤同1.5迁移实验，显微镜下计数，计算取平均值。

1.7倒置显微镜下形态观察

取对数期细胞，接种于24孔板并控制密度为1×105个/孔，培养细胞，按1.3描述方法进行分组处理，继续培养48h，显微镜下观察乳腺癌细胞形态。

1.8双染法检测细胞凋亡

取对数期细胞，接种到6孔板中，每孔约2×105个细胞。置于温箱中，根据分组处理，继续培养48h。以0.25%胰酶消化细胞，离心后弃上清。4℃预冷的70%乙醇固定，调整细胞浓度为1×106个/ml，加入染色剂10ml，置于4℃冰箱中染色30min，流式细胞仪检测凋亡情况，细胞凋亡率（%）=凋亡细胞/细胞总数*100%计算。

1.9Westernblot检测PI3K/Akt通路蛋白表达

取对数期细胞同上处理分组，培养48h，收集各组细胞加入细胞液裂解 15min，用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。将样品放在沸水中加热至蛋白完全变性，拿出样品冷却至室温，取30μg进行电泳，湿转PVDF膜。常温下以5%脱脂牛奶封闭2h，后用TBST清洗三次，一抗Caspase-3、PARP、p-GSK3β、GSK3β、PI3K、p-Akt 、Akt（1:1000）4℃孵育过夜，洗膜，DyLight 800 标记的二抗（1:2000）常温下孵育1h，PVDF清洗膜3次后，用化学发光法进行显影处理，拍照，用ImageJ（v1.7.0）软件对实验所得条带进行定量分析，以β-actin作为内参蛋白，相对表达量=目标蛋白灰度值/参照蛋白灰度值。

1.10统计学方法

数据采用SPSS21.0分析，结果以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差检验，组间两两比较采用lsd-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 EGb-761对细胞抑制率的影响

对照组和EGb-761剂量低、中、高组的抑制率（%）依次为0、27.28±5.66、48.05±4.90、80.30±4.00，计算得F=148.489, P<0.05,组间t检验均有显著性（P<0.05），且EGb-761对DA-MB-231细胞抑制作用呈浓度依懒性，详见图1。

图1 各组抑制率比较（n=5）

Figure 1 Comparison of cell inhibition rate (n=5)

2.2 EGb-761对细胞迁移的影响

对照组和EGb-761剂量低、中、高组的迁移个数分别为379.40±27.46、348.80±17.08、288.00±16.23、224.00±11.38，与对照组比较，EGb-761组细胞穿透数量显著少于对照组且呈剂量依赖，计算得F=78.514,P<0.05,各组相比均差异显著（P<0.05），详见图2、表1。

图2 各组细胞迁移比较(n=5)

Figure 2 Comparison of cell migration in each series (n=5)

表1各组细胞迁移比较（x±s）

Table 1 Comparison of cell migration in each group （x±s）

2.3 EGb-761对细胞侵袭能力的影响

对照组和EGb-761剂量低、中、高组的细胞数分别为272.60±15.37、208.80±16.21、127.20±11.12、69.80±10.66。与对照组比较，EGb-761组细胞侵袭数量明显比对照组少且呈剂量依赖，统计分析F=216.399,P<0.05,各组间比均P<0.05，详见图3、表2。

图3 各组细胞侵袭比较(n=5)

Figure 3 Comparison of cell invasion in each series (n=5)

表2各组细胞侵袭比较（x±s）

Table 2 Comparison of cell invasion in each group（x±s）

2.4 EGb-761对细胞形态的影响

对照组MDA-MB-231细胞为细长不规则状，间隙较小，分布密集。加入银杏叶提取物培养48 h后，细胞间隙增大，密度显著降低，贴壁生长细胞开始脱壁，胞浆出现浑浊，细胞外形收缩呈片状球状，出现细胞肿胀破裂情况，提示处理后细胞会明显发生调亡，详见图4。

图4 各组MDA-MB-231细胞细胞形态变化(n=5)

Figure 4 Cell morphology of MDA-MB-231 (n=5)

2.5 EGb-761对细胞凋亡的影响

对照组和EGb-761剂量低、中、高组的细胞凋亡率（%）分别为2.15±0.41,23.23±2.07，44.69±4.12,65.78±5.26。与对照组比较，EGb-76组细胞凋亡率高于对照组，且呈剂量依赖，统计分析F=306.403,P<0.05,相比均有显著性差异（P<0.05），详见图5、表3。

图5 各组细胞凋亡率比较(n=5)

Figure 5 Comparison of cell apoptosis rate (n=5)

表3各组细胞凋亡率比较（x±s）

Table 3 Comparison of apoptosis rates in each group（x±s）

2.6 PI3K/Akt通路蛋白水平测定结果

与对照组比较，EGb-761处理后各组PARP和PI3K的蛋白含量均明显降低，caspase-3含量显著升高，p-GSK3β和p-AKT水平显著下降(P＜0.05)，EGb-761剂量越高效果越显著。各组比较均有统计学意义（P＜0.05），详见图6、表4。

图6 wb实验结果比较(n=5)

Figure 6 Comparison of PI3K/Akt pathway protein content results (n=5)

表4 各组PI3K/Akt通路蛋白表达

Table 4 Expression of PI3K/Akt pathway protein in each group

3讨论

细胞的增殖和凋亡是非常重要的生理过程，正常情况下细胞的增殖会受到自身限制，细胞凋亡表现稳定。但在癌细胞中这些平衡会被打破，细胞增殖速度异常并失去控制，凋亡途径被阻断，使得癌细胞非常具有危险性[8]。在前期的研究中，实验人员已经发现EGb-761对人乳腺癌细胞具有一定抑制效果，本次实验在之前的基础上进一步的研究EGb-761促凋亡以及可能的影响机制。实验表明，EGb-761可以抑制MDA-MB-23增殖，并且高剂量具有更高的抑制效果，同时对MDA-MB-231的迁移和侵袭也有着同样的功效。观察细胞形态可知，EGb-761处理后的细胞由易转移的飞梭形转变为了迟钝的球形，并且出现了肿胀和细胞器损坏，后续的凋亡实验证明，EGb-761可以诱导MDA-MB-231凋亡，并且和抑制增殖效果一样与剂量相关。

在分子层面上，PI3K/Akt通路参与调节多种细胞生理功能，而乳腺癌的产生和细胞活动的异常存在直接的关系，二者之间存在的一定的联系[9,10]。PI3K 是一种异源二聚体酶，多种信号因子都可以使PI3K活化[11,12]。活化的PI3K通过特异性催化激活胞膜上的PIP3，从而靶向调控Akt。Akt是PI3K重要的下游效应蛋白[13]，活化后的Akt可以通过作用于PARP、GSK3β、caspase-3等因子，进而调节细胞的功能，与肿瘤的形成发展有紧密的关联[14,15]。作为PI3K/Akt的下游分子的PARP蛋白是一种DNA修复酶，在细胞凋亡调控中发挥着十分重要的作用，其主要通过内源性途径调节细胞凋亡，PARP的剪切与caspase-3活化也存在密切关联。caspase-3在细胞凋亡有着重要的作用，研究表明，PI3K/Akt信号通过caspase-3蛋白，引起促凋亡蛋白Bax从细胞质向线粒体外膜移位 ，破坏线粒体膜的完整性，降低膜电位,使得细胞开始凋亡。GSK-3β是一种普遍存在细胞中的调控糖原合成酶，活化的GSK-3β蛋白作用与多种信号分子，可以调节细胞的多种生命活动，但在在肿瘤细胞中GSK-3β代谢会产生异常，使得机体紊乱。有研究表明，PI3K/Akt信号通过caspase-3蛋白

[16]。

本次实验结果显示，与对照组比，EGb-761处理MDA-MD-231后GSK3β和Akt的磷酸化水平降低，提示EGb-761可剂降低GSK3β和Akt的磷酸化水平，同时，PARP、caspase-3、PI3K蛋白含量也明显下降，说明EGb-761通过PI3K/Akt信号通路下调肿瘤细胞中PARP和PI3K的表达，上调caspase-3的表达，进而诱导MDA-MB-231细胞的凋亡。

EGb-761中的主要有效成分为银杏黄酮类化合物。过去研究认为，包括EGb-761在内的多种黄酮类化合物具有抗氧化作用，同时可以影响体内金属离子平衡，调节代谢状态，近几年随着研究愈加深入，发现EGb-761在分子水平上也有巨大的影响作用，可以调控多个信号通路[17]。亢璐等研究发现，EGb761可以通过VEGF/PI3K/Akt1通路清除氧自由基，从而改善大鼠创伤性脑水肿[18]；刘铁钢等在报告中指出，EGb-761对甲状腺癌TPC-1细胞株的抗肿瘤效果与调控PI3K/Akt信号通路密切相关[19]。在EGb-761所属的黄酮类化合物研究中也有相应的结果，韦飞燕等统计研究说明黄酮类中药单体被证实具有显著的抗肿瘤活性，具有诱导凋亡和自噬、抑制增殖和转移的作用，内在机制可能与多个通路相关，其中就包括PI3K/Akt 途径[20]。而关于人乳腺癌的研究中，López-Knowles等学者通过实验证明PI3K通路可以有效抑制肿瘤细胞[21]；Jie B等则在研究报告中指出，抑制PI3K和Akt的活化可以有效的促进乳腺癌细胞的凋亡[22]。本次实验发现EGb-761影响乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡过程，与其他人在不同类型细胞中的研究结果相似，同时通过WB实验，发现EGb-761通过PI3K/Akt途径调控多种蛋白的表达和活化，作用与MDA-MB-231的生命活动。

综上所述，EGb-761通过调控PI3K/Akt途径扼制MDA-MB-231细胞增殖，诱导其凋亡，具有较好的抗肿瘤作用，其机制可能是通过抑制PI3K及Akt的磷酸化，抑制下游蛋白表达，并诱导MDA-MB-231细胞凋亡。本实验结果为乳腺癌的临床治疗提供了新的科学思路和依据。本实验为体外试验，对EGb-761在生物体内的功效未做探讨，能否被机体利用且具体临床疗效，还需要进一步的实验研究验证。

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基金课题：江西省卫生健康委科技计划项目，项目编号：202210940；赣州市科技计划项目，项目编号：GZ2021ZSF039；江西中医药管理局科技计划项目，项目编号：2020B0375

通讯作者：冯赵慧子，赣州市人民医院康复医学科，341000。