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  • 简介:摘要:本研究采用聚合酶链反应 ( PCR)扩增出乙型脑炎病毒 ( JEV) E蛋白基因 , 并进一步克隆入原核表达载体 pMBP-C, 经测序验证无误后转化大肠杆菌 BL21 Gold表达乙型脑炎病毒 E 蛋白。经异丙基巯基半乳糖 ( IPTG)诱导表达后 , 采用十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹 (Western blotting)分析表达产物,表达量约占菌体上清液总蛋白 40 %,分析证实确为乙型脑炎病毒 E蛋白且有生物学活性。本研究为实验室制备乙型脑炎病毒 E蛋白诊断抗原和为今后研制乙脑分子诊断试剂盒和基因工程疫苗打下了基础。

  • 标签: 脑炎病毒 E 蛋白 基因表达 大肠杆菌 优化
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  • 简介:摘要: 为考查中药对大肠杆菌抑菌效果,选取了白头翁、黄连、黄柏等二十余种常见清热解毒、抗菌类药物,进行抑菌试验;分别采用了体外纸片扩散法及体内小白鼠实验,通过观察扩散情况与小白鼠致死及发病情况,考查其对大肠杆菌抑菌效果。结果显示, 23 种中药水提取液中,黄芩、白头翁、黄连对大肠杆菌体外抑菌效果最强,可以为临床应用提供理论基础;其次是金银花、黄柏、菊花、陈皮、白芍、栀子、五倍子等;而石榴皮、土茯苓、木香、艾叶这几种中草药对大肠杆菌几乎没有抑制作用。由 复方 1 : 菊花、五倍子、石菖蒲、 黄芩,与复方 2 : 大黄、黄芩、石菖蒲和金银花,合二为一组成复方组合对体内外抑菌效果较为显著。可能是几种不同中药成分在对大肠杆菌作用过程中产生协同促进作用;而由地榆、白头翁、土茯苓组成复方 7 ,以及黄连、白头翁、木香和甘草组成复方 8 ,抑菌效果并不明显,这与代谢过程中相互抑制作用有关;综合以上,黄芩、白头翁、黄连,以及由石菖蒲、五倍子、黄芩、菊花组成复方,或由石菖蒲、黄芩、大黄、金银花组成复方可以为临床应用提供参考。

    关键词:中药;大肠杆菌;复方;抑菌效果;小白鼠 猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起一类传染性疾病总称。 根据猪生理特性、日龄增长及免疫状态等特征不同,导致疾病发生也存在一定差异性。 常见大肠杆菌病有以下三种:仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病。 1 材料与方法 1.1 试验材料 ( 1 ) 试验动物 健康小白鼠和疑似患有大肠杆菌病猪 ( 2 ) 试验试剂 麦康凯琼脂培养基粉、蛋白胨、牛肉浸膏、琼脂、氯化钠溶液、氢氧化钠溶液 ,超纯水,所有试剂均为分析纯及以上纯度。 ( 3 ) 试验药物 参考《全国中草药汇编》选取了具有清热解毒、抗菌、消炎等疗效中草药二十余种,具体为:白头翁、黄连、黄柏、秦皮、黄芩、栀子、香附、穿心莲、石菖蒲、五倍子、菊花、大黄、金银花、艾叶、马齿苋、甘草、郁金、诃子、白芍、地榆、石榴皮、土茯苓、木香,以上中药材均购自吉林大药房,所有药物经鉴定均符合生药质量标准。 1.2 试验方法 ( 1 ) 培养基制备 培养基为麦康凯琼脂培养基、肉汤培养基,培养方法按照说明书上剂量称取,将其加入超纯水,并搅拌在 121℃, 101KPa下灭菌 30min,以备用 ( 2 ) 细菌分离 第一, 菌种采集:大肠杆菌菌种采集自疑似患有猪大肠杆菌病猪。 第二, 菌种培养:首先使用温水和脱脂棉清洗患有白痢仔猪肛门部位,再用 75% 酒精棉球和碘酊进行消毒。经过彻底清洁、消毒后,将无菌棉拭子插入肛门内,采集直肠粪便病料。随后将样品棉拭子放入无菌生理盐水 10 ml 离心管中,密封保存于 4℃ 冰盒中,快速送至实验室。按照麦康凯琼脂培养基粉说明书要求,制备麦康凯琼脂培养基,于 37℃ 过夜检菌后使用。在超净工作台上,将采集粪便棉拭子涂布于合格麦康凯琼脂培养基中,在生化培养箱中,在 37  环境下,倒置培养 1824 h 。观察培养基,用平板划线法为初步分离大肠杆菌分离株并且进行分离纯化,重复培养 3-5 次。将其接种于营养肉汤中,并置于振荡培养器中处于 37 , 180 r/min 培养 8 h 后采用甘油保存法,与 30% 甘油混合置于 -80℃ 保存、备用,每个菌种保存三管。 第三, 镜检:菌体形态通过革兰氏染色,经过初染、媒染、脱色、复染之后,将载玻片覆上盖玻片,置于 Classica E220LED 双目光学显微镜下观察,拍照记录菌体形态,包括菌体形状、大小、排列方式和革兰氏阴阳性等。 第四, 生理生化鉴定:将分离出大肠杆菌进一步试验,如: VP 试验和尿酶试验、糖发酵试验、三糖铁试验、 MR 试验等各种发酵实验。 第五, 动物试验:将纯化大肠杆菌肌肉注射到小白鼠体内,观察小白鼠生命体态。 ( 3 ) 中药试剂选择 将单味中草药按照中药配制原则、药理、药性并与常用方剂(如白头翁汤)组成八种复方 : 复方 1 为 石菖蒲、黄芩、菊花、五倍子 ; 复方 2 为 石菖蒲、大黄、金银花、黄芩 ; 复方 3 为 大黄、秦皮、艾叶、黄芩 ; 复方 4 为 白头翁、黄柏、秦皮、黄连 ; 复方 5 为 马齿苋、黄柏、五倍子、甘草、白头翁 ; 复方 6 为 郁金、白芍、诃子、黄柏、黄芩、栀子、大黄、黄连 ; 复方 7 为 地榆、土茯苓、石榴皮 ; 复方 8 为 黄连、木香、甘草、白头翁 。 ( 4 ) 药敏实验 第一, 药液制备:分别制备复方 1 至 8 中草药水提液且采用水煎法。分别称取粉碎后中草药复方制剂 50 g ,置于 500 mL 烧杯中,加入 400 mL 超纯水,浸泡 1 h 后,强火加热至沸腾,改用文火煎煮 30min , 4 层纱布过滤,药渣再加入适量超纯水,按上述方法煎煮过滤除去滤渣,合并 2 次滤液,分别制备复方 1 至 8 中草药水提液且采用水煎法。将其分别装入 8 个 100 ml 生理盐水瓶在 121 ℃ 、 101 KPa 条件下灭菌 30 min ,灭菌后,置于 4 ℃ 冰箱中保存,备用。 第二, 纸片制备:取滤纸,用打孔机打成圆形小纸片,取圆形纸片 80 个放入清洁干燥青霉素空瓶中,瓶口使用单层牛皮纸包扎。经高温高压消毒后放入 37 ℃ 恒温烘箱中,使其完全干燥。 第三, 抗菌纸片制作:将上述 80 个纸片均匀分为八组每组 10 个,然后分别放在药液 1 至 8 中。使各纸片充分浸透药液。于 37 ℃ 下过夜干燥后及密封。 第四, 药敏实验:在无菌条件下将培养 24 h 肉汤培养物,用灭菌生理盐水稀释 10 倍,取 0.2 mL 滴加在琼脂平板培养基上,用灭菌棒涂匀,平板置于超净工作台上,在室温下干燥 3-5min ,用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面,等距离放置纸片;置 35℃ 恒温箱内倒置培养 18h 后,观察结果。 2 试验结果 2.1中药对大肠杆菌体外抑菌作用 23 种中药在琼脂纸板上抑菌圈直径大小 : 黄芩 , 抑菌圈直径 1.78mm , 抑菌效果最好 ; 白头翁 , 抑菌圈直径 1.65mm , 抑菌效果最好 ; 黄连 , 抑菌圈直径 1.58mm , 抑菌效果最好 ; 金银花 , 抑菌圈直径 1.45mm , 抑菌效果良好 ; 黄柏 , 抑菌圈直径 1.44mm , 抑菌效果良好 ; 菊花 , 抑菌圈直径 1.32mm , 抑菌效果良好 ; 秦皮 , 抑菌圈直径 1.31mm , 抑菌效果良好 ; 白芍 , 抑菌圈直径 1.26mm , 抑菌效果良好 ; 栀子 , 抑菌圈直径 1.26mm , 抑菌效果良好 ; 五倍子 , 抑菌圈直径 1.22mm , 抑菌效果良好 ; 地榆 , 抑菌圈直径 1.13mm , 有抑菌效果,但不明显 ; 马齿苋 , 抑菌圈直径 1.12mm , 有抑菌效果,但不明显 ; 石菖蒲 , 抑菌圈直径 1.05mm , 有抑菌效果,但不明显 ; 大黄 , 抑菌圈直径 1.05mm , 有抑菌效果,但不明显 ; 香附 , 抑菌圈直径 1.05mm , 有抑菌效果,但不明显 ; 穿心莲 , 抑菌圈直径 0.98mm , 有抑菌效果,但不明显 ; 甘草 , 抑菌圈直径 0.98mm , 有抑菌效果,但不明显 ; 郁金 , 抑菌圈直径 0.96mm , 有抑菌效果,但不明显 ; 诃子 , 抑菌圈直径 0.96mm , 有抑菌效果,但不明显 ; 石榴皮 , 抑菌圈直径 0.90mm , 几乎没有抑菌效果 ; 土茯苓 , 抑菌圈直径 0.90mm , 几乎没有抑菌效果 ; 木香 , 抑菌圈直径 0.90mm , 几乎没有抑菌效果 ; 艾叶 , 抑菌圈直径 0.90mm , 几乎没有抑菌效果 ; 生理盐水 , 抑菌圈直径 0.90mm , 几乎没有抑菌效果 。综上, 这 23 种中药大多数都能对大肠杆菌产生抑菌作用,其中,黄芩,白头翁,黄连抑菌效果最好,金银花,黄柏,菊花等其次,但石榴皮、土茯苓、木香及艾叶在体外对大肠杆菌几乎没有抑菌作用。 2.2复方中草药体外抑菌效果测试 8 种复方对大肠杆菌体外抑菌效果 : 复方 1 - 抑菌圈直径 2.58mm - 抑菌效果最好 ; 复方 2- 抑菌圈直径 2.42mm - 抑菌效果最好 ; 复方 3- 抑菌圈直径 1.12mm - 有 抑菌效果 ,但不明显; 复方 4- 抑菌圈直径 2.15mm - 抑菌效果最好 ; 复方 5- 抑菌圈直径 1.06mm - 有 抑菌效果 ,但不明显; 复方 6- 抑菌圈直径 1.18mm - 有 抑菌效果 ,但不明显; 复方 7- 抑菌圈直径 0.98mm - 有 抑菌效果 ,但不明显; 复方 8- 抑菌圈直径 1.22mm - 抑菌效果良好 ; 生理盐水 - 抑菌圈直径 0.90mm - 抑菌效果良好 - 没有抑菌效果 。综上, 多数组合复方都比单一中药作用效果更明显;其中由石菖蒲、五倍子、黄芩、菊花组成复方 1 抑菌效果显著比单一中药效果好,其次,由石菖蒲、黄芩、大黄、金银花组成复方 2 体外抑菌效果也比较好,而由地榆、石榴皮、土茯苓组成复方 7 体外抑菌效果比单一地榆效果更差,原因可能是几种药物在与大肠杆菌发生作用代谢过程中产生了抑制作用。 2.3复方中草药体内抑菌测试 按照几种复方配制,将中药水提取液注入 8 只 小白鼠体内观察得到情况 : 复方 1 ,死亡 0 只,死亡率 0.0% , 小白鼠状态良好,能够进行正常活动,无不良反应 ; 复方 2 ,死亡 0 只,死亡率 0.0% , 小白鼠状态较好,活动量较正常情况微少 ; 复方 3 ,死亡 1 只,死亡率 12.5% , 小白鼠状态不佳,活动量减少至少一半 ; 复方 4 ,死亡 0 只,死亡率 0.0% , 小白鼠状态良好,能够进行正常活动,无不良反应 ; 复方 5 ,死亡 2 只,死亡率 25% , 小白鼠状态很差,活动量小或几乎不活动 ; 复方 6 ,死亡 2 只,死亡率 25% , 小白鼠状态很差,活动量小或几乎不活动 ; 复方 7 ,死亡 3 只,死亡率 37.5% , 小小白鼠状态很差,活动量小或几乎不活动 ; 复方 8 ,死亡 2 只,死亡率 25% , 小白鼠状态很差,活动量小或几乎不活动 ; 生理盐水 ,死亡 8 只,死亡率 100% , 小白鼠状态很差,活动量小或几乎不活动 。 其中复方 1 抑菌效果显著,其次,复方 2 ,复方 4 体内抑菌效果也比较好,这与体外琼脂纸板扩散实验结果一致;而由地榆,石榴皮,土茯苓组成复方 7 ,以及有黄连、白头翁、木香、甘草组成复方 8 ,效果相对较差,原因可能与代谢过程中相互抑制作用有关。 3 分析与讨论 本课题主要探索了白头翁、黄连、黄柏、秦皮、黄芩、栀子、香附、穿心莲、石菖蒲、五倍子、菊花、大黄、金银花、艾叶、马齿苋、甘草、郁金、诃子、白芍、地榆、石榴皮、土茯苓、木香,这 23 种清热,抗菌中草药,通过试验得出对大肠杆菌抑菌作用最强是黄芩、白头翁以及黄连。体内及体外抗菌试验中对大肠杆菌抑菌效果最强是由石菖蒲、五倍子、黄芩和菊花组成复方以及由石菖蒲、黄芩、大黄和金银花组成复方 , 为兽医临床应用上提供参考。 参考文献 [1]李美发 ,陈作栋 ,梁欢 ,柏峻 ,赵二龙 ,易中华 ,瞿明仁 ,许兰娇 .单一中草药以及复方中草药体外抑菌效果研究 [J].饲料工业 ,2019,40(12):22-26. [2]杨明凡 ,高航 ,万博 ,李庆华 ,陈红英 ,张红英 ,夏平安 .猪源大肠杆菌分离鉴定及白头翁汤对其抑菌试验 [J].中国兽医杂志 ,2019,55(05):55-57+121. [3]陈敏卿 .猪大肠杆菌分离鉴定及其药敏试验 [J].福建畜牧兽医 ,2018,40(06):14-16. 5

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  • 简介:摘要肠道微生物群失衡在克罗恩病(CD)发病中扮演着重要角色,尚未发现CD单一致病微生物,一种特异性定植于CD患者末端回肠黏膜并能侵入肠上皮细胞和巨噬细胞黏附性侵袭性大肠杆菌被认为与CD发病密切相关。对黏附性侵袭性大肠杆菌特殊生物学特性深入研究可能有助于进一步了解CD发病机制。

  • 标签: 克罗恩病 肠道微生态 黏附性侵袭性大肠杆菌
  • 简介:摘要:目的:探讨潍坊地区肉鸡大肠杆菌病原分离鉴定及耐药性特点,为潍坊地区肉鸡大肠杆菌病治疗提供依据。 方法:调查 30 个标准化肉鸡饲养场 100 个鸡群( A 组 )和 160 个大棚肉鸡饲养场( B 组 ), 每个场所均选择 800 只鸡,了解不同鸡群 发病情况、病原学, 分离鉴定禽致病性大肠杆菌,并对常用 10 种抗生素实施药敏试验。 结果:A 组肉鸡大肠杆菌病发病率小于 B 组,差异有统计学意义( P < 0.05 ); A 组病原分离物检出率小于 B 组,差异有统计学意义( P < 0.05 );病原分离菌株耐药性 在 1.79%-89.20% , 其中 头孢噻肟钠、头孢曲松钠、多粘菌素、环丙沙星、恩诺沙星 等耐药性较低。 结论:潍坊地区肉鸡大肠杆菌病发病率较高,同时病原分离鉴定检出率也较高,病原菌存在多重耐药性,需要重视潍坊地区肉鸡大肠杆菌预防,科学饲养,积极采取措施降低病原菌耐药性。

  • 标签: 潍坊地区 肉鸡大肠杆菌病 病原分离鉴定 耐药性 管理对策
  • 简介:摘要目的对5个结核分枝杆菌重组蛋白及其组合物细胞免疫进行评价。方法88份新鲜肝素抗凝人群外周静脉血液,其中42份来自北京市昌平区结核病防治所就诊结核病患者,46份健康志愿者由中国疾病预防控制中心传染病所提供,均为接种过卡介苗(BCG)且没有结核暴露史和任何临床症状体征健康人。以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv DNA为模板,PCR扩增选取5个重组蛋白Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c完整编码基因;通过基因重组蛋白纯化技术,分别克隆、表达和纯化5个重组蛋白作为刺激物,采用效应T细胞酶联免疫斑点试验(ELISPOT)对人群进行细胞免疫检测。结果成功克隆、表达和纯化了Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c重组蛋白;灵敏度分别为50.00%、71.43%、69.04%、73.81%和76.19%;特异度分别为86.96%、76.09%、71.74%、39.13%和36.96%。阳性预测值、阴性预测值、曲线下面积及约登指数分别为52.46%~77.78%、62.96%~74.47%、0.511~0.754和0.129~0.475。除Rv1411c和Rv3418c外,Rv3874、Rv3875和Rv2031c在结核病患者中检测到斑点形成细胞数均高于健康志愿者,差异均具有统计学意义(P值均<0.001)。在5个重组蛋白所构成26种组合物中,灵敏度为80.95%~95.24%,特异度为68.89%~24.44%。随着组合物中重组蛋白个数增加其灵敏度逐渐增加,但特异度随之下降。结论结核分枝杆菌重组蛋白Rv3874、Rv3875和Rv2031c刺激T细胞产生免疫应答能力较强,具有一定抗原性。而Rv1411c和Rv3418c单独用作诊断抗原效能并不理想,与多组分抗原联合构成组合物具有一定应用价值。

  • 标签: 分枝杆菌,结核 重组蛋白质类 免疫,细胞 组合物 实验研究
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  • 简介:摘要:目的 本研究试图将人源 A群轮状病毒( HRV) VP7和 VP4基因片段串联克隆到表面表达载体 pLA上,构建出重组质粒 pLA-VP7-VP4-LTB,并将其电转化到乳酸菌中,制备出表达融合蛋白 pLA-VP7-VP4-LTB重组干酪乳杆菌,并证明其具有良好免疫原性。方法 采用分子克隆相关技术、间接免疫荧光试验、流式细胞术、间接 ELISA试验等。结论 成功制备出能表达融合蛋白重组乳酸菌 pLA-VP7-VP4-LTB/L.casei,并证明该重组菌既可以刺激机体产生体液免疫,也可以刺激机体产生局部免疫,为进一步筛选制备适用于口服轮状病毒基因工程乳酸菌疫苗研究奠定实验基础。

  • 标签: 轮状病毒 VP7蛋白 VP4蛋白 干酪乳杆菌
  • 简介:【摘要】目的:分析荧光定量 PCR对痰结核分枝杆菌检测效率。 方法:对2017.9~2019.9期间我院接收 156例结核病患者为研究对象, 收集其痰标本,分别应用荧光定量PCR检测、改良罗氏培养法、涂片染色法检测结核分枝杆菌,对三种方法检测结果进行比对分析。结果:与改良罗氏培养方法、涂片染色法相比,荧光定量 PCR检测方法阳性检出率提升明显,检测结果差异有统计学意义( P<0.05)。结论:荧光定量 PCR对痰结核分枝杆菌具有较高灵敏度,可提升检出率。

  • 标签: 荧光定量 PCR 结核分枝杆菌 DNA 改良罗氏培养 涂片染色法
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  • 简介:摘要目的描述遗传性大肠癌患者一级亲属对大肠认知情况,并探讨其影响因素。方法应用精简香港中文大学《结直肠癌认知调查问卷》和一般资料调查表,对274例遗传性大肠癌患者一级亲属进行调查,分析该人群大肠癌认知特点及水平并采用χ2检验、秩和检验、Logistic回归进行影响因素分析。结果遗传性大肠癌患者一级亲属对大肠癌具有较高认知者占60.2%(165/274),部分认知者占23.7%(65/274),较低认知者占16.0%(44/274),有序多分类Logistic回归分析显示,年龄、性别、文化程度、婚姻状况、家庭人均月收入、医疗保险情况、血亲亲属中患大肠癌人数等因素影响遗传性大肠癌患者一级亲属大肠癌认知水平(P<0.05),年轻、女性、文化程度高、家庭收入高、单身、公费/城镇医疗保险、有商业保险及血亲亲属中患大肠癌人数>4例者大肠癌认知水平较高。结论遗传性大肠癌患者一级亲属大肠癌认知水平整体较高,但仍有部分研究对象认知水平很低,其大肠癌认知水平受多因素影响,应采取措施提高部分一级亲属大肠癌认知水平以更好地防治大肠癌。

  • 标签: 遗传性 结直肠肿瘤 一级亲属 认知水平 筛查
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  • 简介:摘要组蛋白乙酰化是一种重要表观遗传调控方式,受细胞能量代谢影响并可调控细胞代谢,参与β细胞发育与凋亡、胰岛素抵抗以及炎症反应等多种过程,在糖尿病及其并发症发生发展起重要作用。目前,已有研究针对该靶点进行对糖尿病治疗进行探索,但仍处于初期阶段。

  • 标签: 组蛋白乙酰化 糖尿病
  • 简介:摘要目的流行病学调查认为Omega-3多不饱和脂肪酸(Omega-3 PUFA)与大肠发病率呈负相关,但具体机制仍不明确。本文研究Omega-3 PUFA抑制大肠癌转移差异基因并通过实时PCR验证。方法采用MTT法检测Omega-3 PUFA对大肠癌细胞株活力影响,确定最佳浓度及时间,采用Illumina公司开发的人全基因组表达谱芯片,检测差异基因,运用Real-time PCR验证候选差异基因。结果Omega-3 PUFA抑制HCT116细胞活力作用,以30 µg/ml及48 h时段最明显,OD值为0.42,抑制率为53.78%;Omega-3 PUFA抑制SW480细胞活力作用,以30 µg/ml及48 h时段最明显,OD值为0.29,抑制率为71.01%。从实验组和对照组2株大肠癌细胞中交集出61个共同差异基因,结合文献,与转移有关基因只有COL11A2(下调基因),下调倍数为4~5倍。Real-time PCR验证候选差异基因与基因芯片结果一致。结论Omega-3 PUFA抑制大肠转移,与COL11A2基因有关联。

  • 标签: 实时PCR Omega-3PUFA 大肠癌 转移 差异基因
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